多光子顯微鏡成像技術(shù)：多光子顯微鏡的焦點(diǎn)深度擴(kuò)展方法

雙光子激光掃描顯微鏡結(jié)合鈣指示劑是活體神經(jīng)元信號(hào)探測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的神經(jīng)元分布在三維空間中，監(jiān)測(cè)它們的活動(dòng)動(dòng)態(tài)需要一種能夠快速提高體積成像速率的方式。但是，使用光柵掃描多光子顯微鏡對(duì)大量圖像進(jìn)行成像，如果采用高數(shù)值孔徑（NA）的物鏡來(lái)獲得較高的橫向分辨率時(shí)，會(huì)導(dǎo)致較小的聚焦深度，為了獲得小聚焦深度下的體積成像，

必須通過(guò)一些手段進(jìn)行Z軸掃描，通過(guò)掃描每個(gè)焦平面來(lái)成像許多平面，這大大限制了成像速度。如果可以犧牲軸向圖像信息，通過(guò)擴(kuò)展焦深在一次橫向掃描中實(shí)現(xiàn)體積掃描，也就是體積信息被投影到單個(gè)2D圖像中，就可以大大提高成像速度，這被稱為擴(kuò)展焦深（EDF）成像，對(duì)于要求高時(shí)間分辨率的稀疏群體結(jié)構(gòu)成像（例如神經(jīng)元活動(dòng)的功能成像）特別有用。

顯微鏡的軸向和橫向分辨率均由物鏡的數(shù)值孔徑（NA）決定。高NA可使軸向和橫向分辨率以及所收集的光量最大化；較低的NA將產(chǎn)生較低的軸向分辨率，即更長(zhǎng)的焦深，但同時(shí)會(huì)犧牲橫向分辨率和光收集效率。接下來(lái)要介紹的擴(kuò)展焦深的方法，能夠在保持高橫向分辨率和足夠通光量的同時(shí)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)展焦深。

使用空間光調(diào)制器產(chǎn)生焦點(diǎn)細(xì)長(zhǎng)的貝塞爾光束可以實(shí)現(xiàn)EDF成像，但空間光調(diào)制器體積大，很難與狹窄的顯微鏡空間兼容；相比之下，基于軸棱錐的貝塞爾模塊便宜且緊湊，但它只能產(chǎn)生固定深度的焦點(diǎn)，不適合用于需要焦深連續(xù)變化的各種實(shí)驗(yàn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，2018年，RONGWEN LU等人展示了一種基于軸棱錐的貝塞爾模塊，只需要在該模塊中沿光軸平移一個(gè)透鏡，就可以連續(xù)調(diào)節(jié)貝塞爾焦點(diǎn)的軸向長(zhǎng)度。

圖1（a）貝塞爾模塊裝置圖；（b）當(dāng)D分別為－12mm，0mm和12mm時(shí)實(shí)驗(yàn)測(cè)得點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)；（c）橫向半高全寬、（d）軸向半高全寬、（e）峰值信號(hào)和（f）物鏡后光功率隨L2位移D的變化關(guān)系

形成長(zhǎng)度可變的貝塞爾焦點(diǎn)的模塊裝置如圖1a所示，入射的高斯光束經(jīng)過(guò)軸棱錐和透鏡L1之后被整形為環(huán)形光束，緊接著的環(huán)形光圈掩?？梢宰钃跤奢S棱錐缺陷引起的雜散光，從而塑造雙光子激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的軸向分布。之后光束被透鏡L2和L3投射到振鏡上，再通過(guò)透鏡L4和L5到達(dá)物鏡的后焦面。

這些設(shè)計(jì)與傳統(tǒng)的基于軸棱錐的模塊類似，不同之處在于通過(guò)沿光軸移動(dòng)L2或L3，可以連續(xù)調(diào)節(jié)貝塞爾焦點(diǎn)的軸向長(zhǎng)度。圖1b顯示了D分別為－12mm，0mm和12mm時(shí)的軸向點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，其軸向半高全寬分別為39?m，24?m和14?m。如圖1c－f，從左至右移動(dòng)透鏡L2可以連續(xù)改變橫向和軸向的半高全寬，也就是可以連續(xù)改變焦深，且基于矢量衍射理論的數(shù)值模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常吻合。圖2驗(yàn)證了不同尺寸的環(huán)形掩模對(duì)軸棱錐缺陷的校正作用，發(fā)現(xiàn)較薄的環(huán)形掩模能夠更好地優(yōu)化輸出貝塞爾光束的軸向強(qiáng)度分布，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致更多的功率損耗。

圖2不同環(huán)形掩模得到輸出焦點(diǎn)的軸向強(qiáng)度分布。無(wú)掩模（紅色實(shí)線）；掩模1（藍(lán)色實(shí)線）；掩模2（黑色實(shí)線）；模擬結(jié)果（黑色虛線）

圖3 a，b：使用高斯光束的體成像結(jié)果；c－j：使用貝塞爾光束不同D值時(shí)的成像結(jié)果

該組分別使用高斯光束和貝塞爾光束對(duì)斑馬魚(yú)中腦和后腦的脊柱神經(jīng)元進(jìn)行成像（圖3），發(fā)現(xiàn)即使使用最短的貝賽爾焦點(diǎn)也能比使用高斯光束掃描更多的神經(jīng)元，并且可以提供和二維高斯掃描方式相當(dāng)?shù)臋M向分辨率。最后，該組對(duì)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)脊髓投射神經(jīng)元進(jìn)行體積鈣成像（圖4），研究了參與逃避行為的斑馬魚(yú)的神經(jīng)元?jiǎng)討B(tài)過(guò)程，采用體積速率為50 Hz的貝塞爾光束監(jiān)測(cè)這些神經(jīng)元的活性，鑒定出其中的15個(gè)神經(jīng)元，這些神經(jīng)元表現(xiàn)出敲擊誘發(fā)的鈣瞬變。與高斯光束相比，使用貝塞爾光束時(shí)體積速率提高了26倍。

圖4斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)脊髓投射神經(jīng)元體區(qū)域的50 Hz鈣成像

除了以上提到的使用空間光調(diào)制器和軸棱錐來(lái)獲得貝塞爾光束的方法外，早年最簡(jiǎn)單的方式是使用環(huán)形狹縫和傅里葉變換透鏡，透鏡會(huì)對(duì)經(jīng)過(guò)環(huán)縫的光場(chǎng)作傅里葉變化，在其后焦面處產(chǎn)生近似貝塞爾光束，但是使用一個(gè)簡(jiǎn)單的環(huán)形孔擴(kuò)展焦深會(huì)導(dǎo)致光的大量損失，只有一小部分可用的光會(huì)通過(guò)環(huán)面?zhèn)鬏?，?huì)影響成像。

為了解決使用單個(gè)環(huán)擴(kuò)展焦深光通量不夠的問(wèn)題， BINGYING CHEN等人利用超短脈沖相干長(zhǎng)度短的特性，采用多環(huán)結(jié)構(gòu)的分束掩模，超快激光脈沖經(jīng)過(guò)時(shí)會(huì)被分束掩模分成不同的環(huán)形子束，每個(gè)子束都有時(shí)間延遲，也就是每個(gè)子束在不同的時(shí)間點(diǎn)在物鏡的焦平面上形成貝塞爾焦點(diǎn)。如果每個(gè)環(huán)引入的時(shí)間延遲大大超過(guò)了激光脈沖的持續(xù)時(shí)間，則子束將互不相干，產(chǎn)生的EDF焦點(diǎn)是所有單個(gè)貝塞爾焦點(diǎn)的非相干疊加，如圖5所示。

圖5 a：分束掩模結(jié)構(gòu)圖；b：分束掩模擴(kuò)展焦點(diǎn)深度的原理示意圖；c：模擬的不同環(huán)形光非相干疊加的結(jié)果（1－5表示由內(nèi)到外，EDF：深度擴(kuò)展后的焦點(diǎn)）

基于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的掩模參數(shù)，該組進(jìn)行了數(shù)值模擬，結(jié)果如圖6，最大NA為0．67時(shí)計(jì)算得到的橫向和軸向分辨率分別為550nm和15．98μm，比常規(guī)聚焦方式的軸向尺寸大4．96倍，而橫向半高全寬僅比常規(guī)聚焦方式大7％。

圖6 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的數(shù)值模擬結(jié)果

該組搭建的實(shí)驗(yàn)裝置如圖7所示，由鈦寶石激光器輸出的中心波長(zhǎng)900nm，脈沖寬度140fs的超短脈沖通過(guò)普克爾盒進(jìn)行功率調(diào)節(jié)，經(jīng)過(guò)擴(kuò)束器后進(jìn)入掩模，掩模每層的厚度約為400μm，對(duì)脈沖提供的時(shí)間延遲為720fs，滿足非相干疊加的要求。之后光束經(jīng)過(guò)一系列透鏡和兩個(gè)振鏡被耦合至物鏡光瞳平面，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)展焦深成像。

圖7 實(shí)驗(yàn)裝置圖。1：普克爾盒，光隔離器；2，4，7，8，18：透鏡；3：圓孔；5：虹膜；6：分束掩模；9，12：振鏡；10，11：普羅素目鏡；13：掃描透鏡；14：管狀透鏡；15：二向色鏡；16：物鏡；17：濾波器；19：光電倍增管

對(duì)輸出光束的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)測(cè)量結(jié)果如圖8所示。對(duì)比有掩模和無(wú)掩模的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)發(fā)現(xiàn)，有掩模時(shí)的軸向半高全寬是無(wú)掩模情況下的5．8倍，橫向半高全寬增加15％。降低無(wú)掩模條件的NA使得軸向半高全寬和有掩模時(shí)一致，橫向半高全寬增加約1倍。上述結(jié)果說(shuō)明該掩模能在略微犧牲橫向分辨率的條件下顯著提升焦點(diǎn)深度。為了驗(yàn)證分束掩模在神經(jīng)科學(xué)成像中的應(yīng)用潛力，該組還展示了固定小鼠腦樣本中GFP標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光成像。

圖8 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)測(cè)量結(jié)果。

總之，對(duì)于稀疏群體結(jié)構(gòu)，采用上述擴(kuò)展焦深成像的方法，可以在保持橫向分辨率和光通量的同時(shí)擴(kuò)展焦深，進(jìn)而大大提高成像速度，這在活體神經(jīng)元信號(hào)探測(cè)方面十分有潛力。

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