北京航空航天大學(xué)研發(fā)可解析肺癌細(xì)胞基因突變的納米芯片

近日，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）報(bào)告了全球最新癌癥數(shù)據(jù)：每新增 4 名癌癥患者，就有 1 名來(lái)自中國(guó)，每分鐘有將近 8 名中國(guó)人確診患癌。

對(duì)腫瘤患者來(lái)說(shuō)，一旦腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)特殊行為，細(xì)胞就有可能出現(xiàn)超強(qiáng)耐藥性，這時(shí)無(wú)論服用再昂貴的藥物，也可能是無(wú)濟(jì)于事。

研究發(fā)現(xiàn)，特定細(xì)胞的基因發(fā)生突變，往往是導(dǎo)致上述現(xiàn)象的主要原因。因此，在單細(xì)胞水平上，研究活細(xì)胞行為和基因突變的相關(guān)性，可幫助提供更精準(zhǔn)可靠的臨床治療參考。

基于此，北京航空航天大學(xué)常凌乾課題組開(kāi)發(fā)出一種新型單個(gè)活細(xì)胞水平研究平臺(tái)（Single Living Cell Analysis Nanoplatform，下稱 SLCA 平臺(tái)），借助納米電遞送技術(shù)，該平臺(tái)可將一種用于原位信號(hào)放大的多米諾熒光探針，高效遞送到活細(xì)胞內(nèi)，從而在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的基因突變。

同時(shí)，該研究中基于微孔陣列的納米芯片，擁有細(xì)胞尋址的能力，它能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行耐藥性原位分析。

4 月 8 日，Nano Letters 刊登了相關(guān)論文，論文題為 “Single Living Cell Analysis Nano-platform for High-throughput Interrogation of Gene Mutation and Cellular Behavior” 《用于基因突變和細(xì)胞行為高通量探測(cè)的單個(gè)活細(xì)胞分析納米平臺(tái)》，并成為 Nano Letters 內(nèi)封面文章。

其中，常凌乾擔(dān)任通訊作者，第一作者是北航生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心和生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院董再再博士。

研發(fā)多米諾 DNA 探針，比同類工具反應(yīng)速度快 4 倍

常凌乾團(tuán)隊(duì)利用 SLCA 平臺(tái)對(duì)肺癌患者臨床樣品進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的 EGFR 基因突變和相關(guān)靶向藥物耐受性之間，存在明顯的正相關(guān)性。

也就是說(shuō)，細(xì)胞對(duì)靶向藥的敏感程度、和引起肺癌的某些基因突變細(xì)胞，呈現(xiàn)出比例上的正相關(guān)性。

因此，SLCA 平臺(tái)可為細(xì)胞內(nèi)基因檢測(cè)和單細(xì)胞分析提供一種通用方法，并有望大范圍用于指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)治療。

據(jù)了解，在肺癌基因突變中，EGFR（epidermal growth factor receptor）作為表皮生長(zhǎng)因子受體家族的成員之一，其發(fā)生突變的存在率最高。

雖然 EGFR 靶向藥物可以延長(zhǎng)肺癌患者存活期，但腫瘤細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性，而這會(huì)導(dǎo)致靶向藥物失效。

因此，預(yù)估患者體內(nèi)是否發(fā)生 EGFR 突變，并借此推斷患者的腫瘤細(xì)胞對(duì)于靶向藥物的耐藥性，可有效提高肺癌治療效果。

研究中，常凌乾團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出一種 DNA 探針，名字叫 Domino（下稱多米諾）。通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，這只探針可把成對(duì)的發(fā)夾 DNA 序列，組裝成致密的螺旋鏈。

與靶 RNA 孵育后，多米諾探針會(huì)在 30 分鐘內(nèi)快速反應(yīng)，并使其熒光倍率增強(qiáng)，最終實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的熒光檢測(cè)信號(hào)。

在目標(biāo) RNA 存在的情況下，由于鏈在螺旋方向上的鏈置換反應(yīng)，多米諾探針被迅速觸發(fā)，并在 30 分鐘后，熒光強(qiáng)度會(huì)達(dá)到飽和。

與傳統(tǒng)的分子探針相比，多米諾探針的反應(yīng)速度快了 4 倍，并能將熒光信號(hào)放大 12.5 倍。

為了實(shí)現(xiàn)高效、且安全的探針傳遞，同時(shí)允許在單細(xì)胞水平上、對(duì)細(xì)胞行為進(jìn)行原位觀察，常凌乾課題組開(kāi)發(fā)出一種納米芯片，該芯片可將多米諾探針傳遞到活細(xì)胞中，并可在芯片上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)與觀察。

如下圖所示，從上到下來(lái)看，該納米芯片由三個(gè)部件組成：分別是用于細(xì)胞定位和培養(yǎng)的微孔陣列、用于探針輸送的納米孔、以及用于建立電場(chǎng)的電極。

圖 | 納米芯片結(jié)構(gòu)（來(lái)源：受訪者）

其中，這些微孔陣列膜可被分為上腔和下腔，相關(guān)細(xì)胞和多米諾探針均會(huì)通過(guò)帶有納米孔的微孔陣列膜。

數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的單細(xì)胞排列在微孔陣列中，并與微孔底部的納米孔緊密相連。在外部低電壓下，納米孔會(huì)聚集電場(chǎng)，并在納米孔之間形成偏置電壓，從而穿透細(xì)胞膜。

通過(guò)使用此方法，可以巧妙避免同電荷細(xì)胞膜與多米諾探針之間的斥力問(wèn)題，還能在可調(diào)節(jié)的電場(chǎng)下實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞膜上的精確電穿孔，可控、高效、均勻地將多米諾探針傳遞進(jìn)細(xì)胞。

此外，在芯片上，每個(gè)微孔都有一個(gè)唯一的地址，這樣就能聯(lián)合多米諾探針檢測(cè)并追蹤微孔中的每個(gè)細(xì)胞。

由于這些癌細(xì)胞都位于可尋址微孔中，因此在遞送之后，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞里的 EGFR 基因突變檢測(cè)，以及后續(xù)的耐藥性分析。

另?yè)?jù)悉，在不同濃度的目標(biāo) RNA 存在下，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著目標(biāo) RNA 濃度的增加而增強(qiáng)，并在 100 pM?100 nM 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，這表明多米諾探針具備識(shí)別靶 RNA 的高特異性。

相比傳統(tǒng)的分子信標(biāo)（Molecular beacon，一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈，但沒(méi)有熒光信號(hào)放大功能），在同樣條件下，多米諾探針明顯增加了輸出熒光，它的檢出限比傳統(tǒng)分子信標(biāo)低 100 倍，這說(shuō)明多米諾探針在敏感的基因突變檢測(cè)方面，具備一定優(yōu)勢(shì)。

為了對(duì)樣品進(jìn)行平行測(cè)試，團(tuán)隊(duì)在一個(gè)芯片上設(shè)計(jì)了三個(gè)平行的模塊，每個(gè)芯片單元在聚碳酸酯納米膜上制備有 10000 個(gè)微孔，從而實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞分析。

每個(gè)微孔只有 20μm 大小，為的是能適應(yīng)大多數(shù)細(xì)胞的尺寸。研究中，他們采用納米孔直徑為 800nm 的納米孔膜，將電場(chǎng)定位到細(xì)胞膜上，隨后通過(guò)穿孔細(xì)胞膜，并利用電泳方式，將多米諾探針?biāo)偷郊?xì)胞中。

為了定位芯片上的每個(gè)單元，納米孔膜上的微孔被劃分成一個(gè)個(gè) 10×10 微孔的方形陣列，并使用數(shù)字進(jìn)行標(biāo)記。

例如，標(biāo)記為 “4?9_J-5” 的微孔，位于納米孔膜的第四行和第九列。也就是說(shuō)，即使芯片被重新安置，任何單個(gè)細(xì)胞也都能被尋址。

此外，當(dāng)這些細(xì)胞排列成大規(guī)模的規(guī)則陣列，也可為后續(xù)基因分析和細(xì)胞行為的跟蹤，提供精確的單細(xì)胞分析平臺(tái)。

即使在 10V 的低電壓下，多米諾探針也能穿透細(xì)胞膜。另外，常凌乾團(tuán)隊(duì)還比較了單個(gè)細(xì)胞在不同微孔和 BEP 中的跨膜電位。

由于微孔所提供的環(huán)境是均勻的，因此微孔中的細(xì)胞具備幾乎相同的跨膜電位，相比傳統(tǒng)的電穿孔方法（bulk electroporation），優(yōu)勢(shì)非常明顯。

這一結(jié)果表明，基于微孔陣列的導(dǎo)電納米芯片，能為每個(gè)細(xì)胞提供均勻分布的電場(chǎng)，這對(duì)于微孔中細(xì)胞的均勻電穿孔是非常必要的，也是實(shí)現(xiàn)多米諾探針均勻?qū)щ姷那疤釛l件。

研究中，常凌乾團(tuán)隊(duì)分別選取了三種類型的肺癌細(xì)胞 H1975、HCC827 和 A549，來(lái)作為 EGFR L858R 突變陽(yáng)性、EGFR 19 外顯子缺失突變陽(yáng)性、以及 EGFR 突變野生型的模型。

考慮到高檢測(cè)信號(hào)和低細(xì)胞損傷的要求，他根據(jù)多米諾探針和碘化丙啶在細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，確定了 10 V 和 200 個(gè)脈沖作為最佳電傳遞條件。

他們發(fā)現(xiàn)，用電遞送納米芯片將多米諾探針注入細(xì)胞，30 分鐘內(nèi)突變細(xì)胞就會(huì)變亮。這些結(jié)果證實(shí)，組裝的多米諾探針在不影響累積率的情況下，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)目標(biāo) RNA 的熒光檢測(cè)。

流式細(xì)胞儀的結(jié)果也表明，本次研究中的納米平臺(tái)，可區(qū)分 90% 以上的突變陽(yáng)性細(xì)胞。

考慮到所有細(xì)胞都可以在微孔陣列上直接被觀察到的特性，常凌乾團(tuán)隊(duì)對(duì)變亮的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出突變陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

對(duì)比后他們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的突變陽(yáng)性率與流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的結(jié)果一致，這表明該納米平臺(tái)具有高通量、單細(xì)胞分辨率的基因分析能力。

為了獲得較高的加載效率，該團(tuán)隊(duì)還應(yīng)用一種基于真空的設(shè)置，來(lái)將細(xì)胞加載到微孔中，從而讓細(xì)胞效率達(dá)到 85% 以上。

此納米平臺(tái)的遞送效率和細(xì)胞活性均達(dá)到 90% 以上，這也表明它在活細(xì)胞操作、探針遞送和細(xì)胞行為分析方面，具有很高的可行性和良好的性能。

概括來(lái)說(shuō)，該研究工作研發(fā)了一種納米生物芯片，在原位進(jìn)行高通量活細(xì)胞培養(yǎng)，并在活細(xì)胞內(nèi)探測(cè)突變基因，以及時(shí)空可控的分析同一細(xì)胞行為。未來(lái)有望能通過(guò)技術(shù)轉(zhuǎn)化，應(yīng)用于臨床藥物篩選和精準(zhǔn)醫(yī)療。這也是常凌乾從事科研的一個(gè)長(zhǎng)期愿景。

談及未來(lái)，他告訴 DeepTech，國(guó)家十四五規(guī)劃已明確將單細(xì)胞技術(shù)、創(chuàng)新藥物作為優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域。能在單細(xì)胞精度解析細(xì)胞的技術(shù)，是未來(lái)生物技術(shù)領(lǐng)域的重點(diǎn)之一。他們課題組將繼續(xù)致力于設(shè)計(jì)新型的可以在單細(xì)胞精度上操控和改造細(xì)胞的新技術(shù)，并為未來(lái)能直接應(yīng)用于臨床診斷和在體治療而奮斗。

原文標(biāo)題：每分鐘8名中國(guó)人確診患癌！北航教授研發(fā)納米芯片，30分鐘即可解析肺癌細(xì)胞基因突變 | 專訪

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