纖維化和再生分子軌跡的基本機(jī)制研究

再生是組織修復(fù)的“必殺技”，但皮膚損傷通常會(huì)產(chǎn)生纖維化的、無(wú)功能的疤痕。疤痕是指皮膚損傷后的纖維化，通過(guò)用非功能性結(jié)締組織替代功能性組織來(lái)確保傷口能夠盡快愈合。由于疤痕沒(méi)有皮膚的毛發(fā)或腺體，因此也不具有正常的體溫調(diào)節(jié)或屏障功能。盡管纖維化帶來(lái)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)巨大，但目前尚無(wú)有效的治療方法，部分原因是缺乏對(duì)再生和纖維化愈合的基本機(jī)制的了解。所以想要發(fā)展促再生療法，需要深刻理解從損傷到纖維化或再生的分子軌跡。

近日，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究組在Cell Stem Cell（IF：24.633）上發(fā)表了一篇題為Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing的文章，該研究以單細(xì)胞多組學(xué)方式（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+蛋白質(zhì)組）描繪了YAP抑制背景下瘢痕與傷口再生的分子軌跡。 研究發(fā)現(xiàn)，使用YAP (Yes-associated protein) 抑制劑可以防止成纖維細(xì)胞纖維化，并產(chǎn)生ENF (En-1-negative fibroblasts) 介導(dǎo)的再生，這一過(guò)程包括真皮附件如毛囊 (HF) 和腺體的恢復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的結(jié)構(gòu)與未發(fā)生損傷皮膚 (UW) 的結(jié)構(gòu)相同以及具有相似的彈性。

纖維化和再生創(chuàng)傷的多模態(tài)分析

研究分析了7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠創(chuàng)面和皮膚：UW皮膚、術(shù)后第2天（炎癥期）、術(shù)后第7天（成纖維細(xì)胞增殖期）、術(shù)后第10天、術(shù)后第14天（傷口重新上皮化、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)）、術(shù)后第21天和術(shù)后第30天（成纖維細(xì)胞重塑ECM）。采用夾板切除傷口模型，該模型能夠防止皮膚松弛小鼠典型的傷口快速收縮，從而可以對(duì)傷口恢復(fù)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控。傷后立即在創(chuàng)面注射YAP抑制劑或?qū)φ站彌_液，對(duì)傷口進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程多模分析。 對(duì)照組創(chuàng)面形成明顯的纖維瘢痕，有密集、線性排列的ECM纖維，無(wú)毛囊和腺體；而YAP抑制劑處理后的創(chuàng)面，有毛囊和腺體再生，ECM纖維密度較低，且生長(zhǎng)方向更隨機(jī)。通過(guò)YAP敲除對(duì)該結(jié)果進(jìn)行再次確認(rèn)，抑制劑與對(duì)照組之間處理的差異并非由于抑制劑的脫靶效應(yīng)引起。 根據(jù)FACS策略進(jìn)行細(xì)胞分類，分離成纖維細(xì)胞(Lin-) 和其他細(xì)胞 (主要是免疫細(xì)胞；Lin+)。對(duì)一半的細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，總計(jì)2986個(gè)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在YAP抑制劑處理的創(chuàng)面中輕微增加；然而，對(duì)照組和YAP抑制劑創(chuàng)面的細(xì)胞比例大體相似，這表明YAP、抑制劑可能通過(guò)改變細(xì)胞表型而不是相對(duì)表征（或通過(guò)改變細(xì)胞類型中的亞群表征）來(lái)誘導(dǎo)再生。剩余的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析（timsTOF質(zhì)譜分析）。主成分分析發(fā)現(xiàn)Lin-和Lin+蛋白組學(xué)標(biāo)本在不同時(shí)間點(diǎn)上差異很大，而PBS樣本和YAP抑制劑樣本的差異則比較狹窄，這表明蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以在更廣泛的修復(fù)動(dòng)力學(xué)中捕獲連貫的纖維化變化。

疤痕形成與再生創(chuàng)面修復(fù)的多模態(tài)分析

(B)創(chuàng)傷愈合隨時(shí)間變化的小鼠配對(duì)多模態(tài)分析實(shí)驗(yàn)策略。

(C)按細(xì)胞類型（左上）、處理組（右上）、小鼠個(gè)體（左下）和POD（右下）著色的scRNA-seq細(xì)胞的多重投影。

(D)PBS和維替泊芬（YAP抑制劑）處理的傷口按時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞類型比例。

(E)Lin-（成纖維細(xì)胞，上）和Lin+（非成纖維細(xì)胞，下）細(xì)胞。

(F)頂部，量化294個(gè)ECM參數(shù)的圖像處理和分析管道示意圖輪廓。底部為對(duì)照（左）和椎體芬（右）傷口隨時(shí)間的t-SNE圖。綠色陰影區(qū)域，UW皮膚簇；疊加箭頭，ECM隨時(shí)間演化。

識(shí)別修復(fù)的分子軌跡

因?yàn)槌衫w維細(xì)胞是瘢痕形成的主要驅(qū)動(dòng)因素，研究假設(shè)YAP抑制劑通過(guò)改變成纖維細(xì)胞表型促進(jìn)再生，并將scRNA-seq分析集中在成纖維細(xì)胞上。單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)再生過(guò)程和纖維化過(guò)程并不是相互排斥的，具有促再生活性的細(xì)胞可能存在于瘢痕創(chuàng)面之中，但是在沒(méi)有干預(yù)的情況下（例如YAP抑制劑處理），促纖維化分子的反應(yīng)會(huì)覆蓋再生的活性，并導(dǎo)致纖維化瘢痕表型。 此外，還分析了另外兩種與傷口相關(guān)的細(xì)胞亞群：骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。髓系細(xì)胞假時(shí)間分析顯示，炎癥基因（如Ccl6、Ccl9和Cxcl2）在早期富集，抗原呈遞基因（如H2復(fù)合物）在后期富集。然而，這些基因在PBS和YAP抑制劑細(xì)胞中表達(dá)相似，表明該分析沒(méi)有區(qū)分纖維化和再生愈合。淋巴樣細(xì)胞假時(shí)間分析也沒(méi)有區(qū)分纖維化和再生的傷口，而是分別反映了早期和晚期的NK和B/T細(xì)胞浸潤(rùn)。發(fā)現(xiàn)抑制劑處理與對(duì)照組相比，免疫細(xì)胞的組成并沒(méi)有出現(xiàn)太大的差異。因此，疤痕表型是否產(chǎn)生并非是由于免疫細(xì)胞的差異，其原因可能還是主要集中在成纖維細(xì)胞之中。 使用CellChat分析scRNA-seq數(shù)據(jù)。CellChat強(qiáng)調(diào)了再生臂中涉及疤痕 (PBS) 成纖維細(xì)胞和非典型Wnt信號(hào)的促炎信號(hào)（如CXCL和IL6）的增加。這些獨(dú)特的功能富集項(xiàng)，以及該組中較低的Dpp4表達(dá)，暗示了由非瘢痕性ENF設(shè)計(jì)的獨(dú)特的分子愈合軌跡。

成纖維細(xì)胞相互作用的CellChat分析

(A)細(xì)胞群對(duì)間配體-受體相互作用的強(qiáng)度。邊緣寬度與配體-受體對(duì)的數(shù)量成正比。

(B)如(A)中，按細(xì)胞種群劃分的子集。

(C)熱圖顯示了基于指定信號(hào)網(wǎng)絡(luò)(ncWNT, noncanonical Wnt)的計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中心性度量的每個(gè)細(xì)胞群的相對(duì)重要性。

(D和E)推斷出的分泌細(xì)胞輸出(D)和輸入(E)通信模式，顯示出推斷出的潛伏模式和細(xì)胞群之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系(左)和信號(hào)通路(右)。

傷口纖維化和再生軌跡標(biāo)記物的研究

基于綜合多模態(tài)分析，試圖驗(yàn)證不同創(chuàng)傷表型中關(guān)鍵基因的相關(guān)性。圖譜中差異表達(dá)的基因指向了Wnt信號(hào)通路，包括Wnt的靶標(biāo)基因、拮抗基因以及一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子Trps1。先前的研究表明Trps1是Wnt信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子，且與皮膚腺體的發(fā)育、生長(zhǎng)和增殖相關(guān)。通過(guò)Trps1基因敲除以及過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究確認(rèn)該基因?qū)τ趥谠偕潜匾页浞值摹ＶС至薊NF介導(dǎo)的愈合（低Dpp4）在YAP抑制（低Ankrd1）的傷口中通過(guò)Wnt激活（高Trps1和Rspo1）實(shí)現(xiàn)HF再生這一發(fā)現(xiàn)。

確定Trps1在再生中的功能意義

鑒于Trps1在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、HF形態(tài)發(fā)生和YAP調(diào)控中的重要性，以及Trps1+成纖維細(xì)胞和HF再生的空間關(guān)系，研究試圖確定Trps1在創(chuàng)面再生中的作用。綜合多模態(tài)分析區(qū)分了兩種修復(fù)軌跡。第一種是EPF介導(dǎo)的 (Dpp4+)，以機(jī)械激活（高核YAP，Ankrd1+，Trps1-）為特征，導(dǎo)致疤痕ECM。二是ENF介導(dǎo) (Dpp4-)，缺乏機(jī)械活化（低核YAP，Ankrd1-，Trps1+），并通過(guò)Wnt激活導(dǎo)致正常ECM和HF的再生。 總結(jié)一下，該研究通過(guò)對(duì)傷口再生進(jìn)行YAP抑制劑處理后的長(zhǎng)時(shí)程多模分析，建立了傷口再生的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及蛋白質(zhì)圖譜，對(duì)研究皮膚傷口再生與纖維化瘢痕形成的阻斷具有重要價(jià)值。 審核編輯：郭婷