一種響應多種芳香族和吲哚類誘導劑的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器系統(tǒng)

變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（Allosteric transcription factor，aTF）包含幾個大的蛋白質(zhì)家族，能夠通過結(jié)合效應物引發(fā)別構(gòu)效應進而準確地調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。其分子機制主要是通過小分子的結(jié)合，能夠使得DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生變化，使在特定的DNA結(jié)合序列上發(fā)生結(jié)合或解離。aTF是微生物工程中的重要工具，在代謝工程、生物技術(shù)和合成生物學中都有著廣泛的應用。 最近，加拿大康科迪亞大學（Concordia University）的研究人員在《ACS Synthetic Biology》（IF=5.11）期刊上發(fā)表了一項重要研究成果，該團隊開發(fā)了一種響應多種芳香族和吲哚類誘導劑的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器系統(tǒng)，該方法利用空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）的TetR家族阻遏物CmeR，構(gòu)建了aTF基因線路，該線路可在大腸桿菌和釀酒酵母中作為水楊酸生物傳感器，同時也證明了調(diào)節(jié)CmeR的啟動子對多種芳香和吲哚誘導劑也可起響應。

研究人員一開始發(fā)現(xiàn)來自空腸彎曲桿菌的TetR家族抑制因子——CmeR，它能夠調(diào)節(jié)外排泵來響應腸道膽汁鹽的變化，并且CmeR還被證明可以結(jié)合水楊酸和甘油，包括脂肪族、膽汁鹽和芳香族分子，具有多配體特異性。其多配體特異性引發(fā)了研究人員的興趣，他們想利用CmeR的這一特性，設(shè)計新的基因線路。 ?首先，研究人員構(gòu)建了一個基因線路，來研究大腸桿菌中能調(diào)控CmeR的誘導物，其中CmeR用IPTG誘導的Ptac啟動子表達，第二個啟動子P2表達綠色熒光蛋白（eGFP），該啟動子能響應水楊酸。

大腸桿菌中的基因線路 由于eGFP的啟動子響應水楊酸，如果CmeR的表達量變大，會與P2啟動子競爭水楊酸，導致GFP表達降低，因此通過誘導CmeR的表達可以抑制熒光（即抑制eGFP的表達），而加入越來越多的誘導劑水楊酸，會導致CmeR與水楊酸結(jié)合飽和，同時激活P2啟動子，表達更多的eGFP。當水楊酸添加到1mM時候，eGFP的表達量是添加1mM IPTG 的情況下的5倍。通過調(diào)節(jié)IPTG和水楊酸濃度，我們可以進一步調(diào)控eGFP的表達水平。 ?接著，研究人員探索了CmeR的配體特異性。首先將攜帶該基因線路菌株去“感受”各種芳香族、吲哚和脂肪族分子。通過觀察報告基因eGFP的熒光強度，來表征CmeR的響應程度。熒光強度的增加范圍從1.1倍（兒茶酚）到3.8倍（植物生長素吲哚-3-乙酸或IAA），同時也利用流式細胞儀表征了這些分子的劑量-響應，實驗表明除了鑒定的同源誘導劑外，受CmeR調(diào)節(jié)啟動子似乎也受色胺（色氨酸的胺衍生物）的最低程度誘導，而酪胺（酪醇的胺衍生物）不誘導表達。

大腸桿菌表達情況 ?之后研究人員在真核生物釀酒酵母中也實現(xiàn)了該基因線路的功能。在這個線路中，CmeR由強啟動子PTDH3啟動表達。綠色熒光蛋白（EnvyGFP）由強啟動子PCCW12表達，通過修飾，使PCCW12具有水楊酸響應性。

釀酒酵母中的基因線路 研究人員用類似于在大腸桿菌的實驗，得到的數(shù)據(jù)也證明CmeR在釀酒酵母中充當轉(zhuǎn)錄抑制因子，并且可被水楊酸誘導。并且也用相同的分子對基因線路劑量-響應的進一步表征，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和釀酒酵母中CmeR誘導曲線之間存在差異，后者表現(xiàn)出最大的熒光誘導，范圍從1.8倍（乙酰水楊酸酯）到5倍（對香豆酸酯）。

釀酒酵母表達情況 釀酒酵母回路與大腸桿菌回路相比，釀酒酵母CmeR回路中對其中許多分子都起反應，包括對同源誘導物水楊酸的反應，但總體上有所減弱，這可能是由于兩種基因線路設(shè)計上差異，例如大腸桿菌是從多拷貝載體表達的，而在釀酒酵母中是單拷貝基因組整合。 ?總的來說，研究人員分別在原核生物大腸桿菌和真核生物釀酒酵母中對基于CmeR的水楊酸細胞生物傳感器進行了構(gòu)建和表征。除了水楊酸、膽汁鹽、膽酸鹽和牛磺膽酸鹽外，還鑒定了多種芳香族和吲哚類誘導劑可作為大腸桿菌中CmeR的新配體。此前酪醇、色氨酸和酪胺都沒有作為aTF調(diào)節(jié)的誘導劑。 值得一提的是，這種多配體特異性在同一途徑中會導致不同分子可能存在顯著的串聯(lián)干擾，在代謝工程應用中直接利用CmeR會受到特異性的限制。但是利用這一特性，可以將CmeR這種多配體特異性使其成為檢測分子的工具，以及定向進化的良好靶點。同時，鑒于CmeR配體的雜亂性，也可以研究其他芳香族和吲哚類分子在誘導空腸彎曲菌抗生素抗性中是否起作用。

論文鏈接： https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00063

審核編輯 ：李倩