幾種典型的大視場(chǎng)光學(xué)顯微成像技術(shù)及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

摘要：光學(xué)顯微成像技術(shù)具有實(shí)時(shí)、高分辨率和非侵入性等特點(diǎn)，其成像尺度可跨越細(xì)胞、組織乃至生命體，極大地拓展了人們對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)邊界。然而，受限于光學(xué)顯微成像系統(tǒng)有限的空間帶寬積（Space-bandwidth Product，SBP），常規(guī)的光學(xué)顯微鏡難以同時(shí)兼顧視場(chǎng)大小和分辨率，使得顯微成像在大視場(chǎng)生物成像應(yīng)用中受到較大的限制，例如對(duì)腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以突觸為單位的神經(jīng)回路成像。近年來(lái)，大視場(chǎng)光學(xué)顯微成像技術(shù)得到不斷的發(fā)展，其SBP相較于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡有了十倍甚至百倍的提升，在保持高分辨率的基礎(chǔ)上拓展了成像視場(chǎng)，滿足了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重大問(wèn)題的研究需求。本文介紹了近年來(lái)幾種典型的大視場(chǎng)光學(xué)顯微成像技術(shù)及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，并對(duì)其未來(lái)發(fā)展做了展望。

關(guān)鍵詞：光學(xué)顯微；空間帶寬積；大視場(chǎng)成像；活體成像

1. 引言

光學(xué)成像系統(tǒng)的信息通量常用空間帶寬積（Space-Bandwidth Product，SBP）來(lái)衡量，SBP是一個(gè)無(wú)量綱數(shù)，可以理解為系統(tǒng)視場(chǎng)（Field of view，F(xiàn)OV）內(nèi)可分辨的像素點(diǎn)個(gè)數(shù)， SBP越大，系統(tǒng)可傳輸?shù)男畔⒕驮截S富。常規(guī)的光學(xué)顯微鏡，其成像的SBP在數(shù)百萬(wàn)量級(jí)。系統(tǒng)的SBP提升主要受兩個(gè)因素限制：一是探測(cè)器的像素尺寸和像素?cái)?shù)量，目前隨著以sCMOS為代表的大尺寸高分辨率相機(jī)的發(fā)展，探測(cè)器的像素?cái)?shù)已經(jīng)可以達(dá)到2×107,像素尺寸1.5 μm，因此探測(cè)器已不再是系統(tǒng)SBP的瓶頸；二是成像光路，主要受制于顯微系統(tǒng)的成像物鏡。常用的商業(yè)顯微物鏡，其SBP在不考慮離軸像差影響的情況下，一般不超過(guò)107，因此提升成像光路的SBP是提升整個(gè)系統(tǒng)大視場(chǎng)光學(xué)顯微成像能力的有效途徑。

提升系統(tǒng)SBP的基本思路有兩種，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是在保持分辨率的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大視場(chǎng)；或者在維持視場(chǎng)的基礎(chǔ)上，提升分辨率。目前，光學(xué)顯微系統(tǒng)的分辨率分布在高至衍射極限的約200 nm，低至數(shù)個(gè)μm范圍內(nèi)，由物鏡的數(shù)值孔徑（Numerical Aperture，NA）和工作波長(zhǎng)λ決定。在實(shí)際應(yīng)用中，分辨率可提升的范圍有限，以熒光顯微成像中的結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（Structured Illumination Microscopy，SIM）為例，使用線性結(jié)構(gòu)光照明樣品的方法最多可以將分辨率提升一倍，雖然使用非線性結(jié)構(gòu)光可以實(shí)現(xiàn)更高的提升倍率，然而強(qiáng)烈的光損傷使這一方法并不常用，且實(shí)際可提升的倍數(shù)也有限。與之相似的還有傅里葉疊層顯微技術(shù)（Fourier Ptychography Microscopy，F(xiàn)PM），通過(guò)頻域多角度照明的方法實(shí)現(xiàn)視場(chǎng)內(nèi)分辨率的數(shù)倍提升。因此，利用分辨率提升的措施使SBP達(dá)到十倍百倍的提升，并不現(xiàn)實(shí)。 而基于擴(kuò)大成像視場(chǎng)，進(jìn)而提高獲取圖像像素?cái)?shù)的方法，已經(jīng)得到了有效的驗(yàn)證。一個(gè)常用的做法是用高NA，小視場(chǎng)的成像物鏡，對(duì)樣品做多次成像，再用二維互相關(guān)技術(shù)等將各子視場(chǎng)的圖像拼接，實(shí)現(xiàn)高分辨率的超大視場(chǎng)圖像獲取。這一方法在組織切片成像，病理診斷等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。拼接成像的優(yōu)勢(shì)在于這一技術(shù)非常成熟，系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單。電動(dòng)樣品位移臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)樣品微米級(jí)精度的二維或三維移動(dòng)，物鏡掃描系統(tǒng)和自動(dòng)對(duì)焦算法也可以使物鏡在樣品每次移動(dòng)后自動(dòng)對(duì)焦并成像。因此無(wú)論是用現(xiàn)有顯微鏡改造，還是購(gòu)置新品，實(shí)現(xiàn)拼接的大視場(chǎng)成像均不困難。然而，對(duì)于拼接成像技術(shù)，由于其每個(gè)子視場(chǎng)在時(shí)間上和空間上的采集都是離散的，因此需要更多的采集時(shí)間，這些時(shí)間更多的被用于樣品移動(dòng)和物鏡對(duì)焦，而不是光子采集。長(zhǎng)時(shí)間采樣時(shí)，來(lái)自溫度的變化或環(huán)境的振動(dòng)有可能導(dǎo)致樣品離焦以及產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)偽影，高NA的物鏡對(duì)于環(huán)境變化則更為敏感。此外，較長(zhǎng)的采樣時(shí)間也限制了這一方法的應(yīng)用范圍，如大視場(chǎng)的生物樣本實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)。

因此，提升分辨率或者是拼接成像的方法對(duì)成像系統(tǒng)SBP的提升都存在各自的弊端：前者的提升能力有限，難以滿足大視場(chǎng)光學(xué)顯微生物成像的需求；后者耗時(shí)太長(zhǎng)，不適用于快速的在體觀測(cè)。一類有效的解決辦法是直接擴(kuò)大成像視場(chǎng)來(lái)提升SBP，它可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲取高像素?cái)?shù)圖像。需要注意的是，系統(tǒng)的SBP受空間分辨率和視場(chǎng)范圍影響，會(huì)決定單次成像的像素?cái)?shù)上限，而系統(tǒng)的實(shí)際像素?cái)?shù)還會(huì)受到探測(cè)器的限制，因此探測(cè)器的選型需要和系統(tǒng)設(shè)計(jì)匹配。

圖1. 大視場(chǎng)物鏡雙光子腦成像。(a)成像系統(tǒng)光路圖和物鏡實(shí)物圖（左上）；(b) 活體鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的雙光子成像，深度為150 μm；(c) (b)中虛線框內(nèi)的細(xì)節(jié)放大圖。

圖2. 基于散斑光片照明的大視場(chǎng)成像系統(tǒng)[25]。(a) 系統(tǒng)光路示意圖，激光經(jīng)ground glass disk形成的散斑圖案投影在體積為4.4×3×3 mm3的樣品內(nèi)，形成厚度約為3 μm的散斑光片照明；(b) 用光片照明模式實(shí)現(xiàn)斑馬魚全身成像；(c)用共聚焦模式實(shí)現(xiàn)的斑馬魚全身成像。

圖3. 微透鏡的排列與掃描方向示意

圖4. 陣列顯微系統(tǒng)[39]。(a) 陣列顯微系統(tǒng)光路設(shè)置；(b) 小鼠腎臟切片的高通量成像；(c) (b)中紅色框內(nèi)的放大圖。

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4. 總結(jié) 綜上所述，高SBP顯微成像儀的發(fā)展路線多樣，在性能上也各自取得了很好的突破?；谕哥R成像的三種系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)SBP的突破相對(duì)更復(fù)雜，成本更高，但成像的保真度更高，應(yīng)用場(chǎng)景更廣；而基于無(wú)透鏡計(jì)算成像的片上顯微實(shí)現(xiàn)SBP的突破更簡(jiǎn)單，更直接，對(duì)算法和傳感器技術(shù)進(jìn)步的依賴更強(qiáng)，但是其分辨率和成像保真度均有待進(jìn)一步提升，應(yīng)用場(chǎng)景相對(duì)受限。目前，高SBP顯微成像儀多用于寬場(chǎng)成像，其與相對(duì)成熟的各類成像模態(tài)（雙光子，超分辨等）、制樣技術(shù)（組織光透明，層切，膨脹等）的合理搭配，將會(huì)使它的應(yīng)用場(chǎng)景得到有力的拓展，文中也介紹了一些成功的實(shí)踐案例。除了以上提到的四類光學(xué)顯微成像技術(shù)外，光學(xué)相干層析（Optical Coherent Tomography, OCT）、光聲顯微成像等也在大視場(chǎng)成像領(lǐng)域取得了很好的成果，其成像原理雖有差異但實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)顯微成像的方法相似——多次掃描與應(yīng)用高SBP成像物鏡等。目前大視場(chǎng)光學(xué)顯微成像技術(shù)仍普遍面臨成像幀率這一瓶頸，但隨著傳感器性能和計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步，這一問(wèn)題也必將獲得有效的解決，有望為大視場(chǎng)顯微生物成像提供更好的工具選項(xiàng)。