基于白介素6的微流控電化學磁免疫傳感器

近日，英國期刊Talanta在線刊登香港科技大學電子與計算機工程系Chiye Zhang研究團隊的研究成果“Microfluidic electrochemical magnetoimmunosensor for ultrasensitive detection of interleukin-6 based on hybrid of AuNPs and graphene”，詳細報道了用于檢測類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）潛在生物標志物——白介素6（interleukin-6，IL-6）的微流控電化學磁免疫傳感器。

類風濕關節(jié)炎（RA）是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病，致殘率高、預后差，目前RA的治療仍然依賴于抑制炎癥。雖然自身免疫性疾病無法治愈，但早期診斷和定期治療可以顯著減輕癥狀。

研究表明，多種細胞因子和蛋白酶參與RA的發(fā)病機制，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）。這些細胞因子之間的協(xié)同作用在代謝誘導中至關重要。IL-6是一種由多種細胞（包括T細胞、B細胞、單核細胞和成纖維細胞）合成的多效性炎癥因子。在RA患者血清中，除TNF-α和IL-1β外，還有大量IL-6，據(jù)相關研究報道，IL-6的表達水平與RA疾病活動指標呈正相關。

因此，開發(fā)一種靈敏、快速、定量檢測IL-6的診斷工具，對于RA的早期檢測顯得至關重要。在該項研究中，研究人員將電化學傳感器、微流控和磁顆粒三者結合起來，開發(fā)了一種基于石墨烯和金納米顆粒的新型集成微流控電化學磁免疫傳感器，用于定量血清樣本中的IL-6。

微流控電化學磁免疫傳感器的原理

微流控電化學磁免疫傳感器是通過集成微型金電極和微流控腔室，通過電化學方法在微型金電極表面修飾石墨烯和金納米顆粒，促進電子轉移，如圖1所示。

圖1 微流控電化學磁免疫傳感器的檢測原理圖。

首先，在微流控腔室外構建好磁珠免疫夾心復合物。在待測物（IL-6）、生物素化檢測抗體存在的情況下，由于捕獲抗體磁珠、待測物及生物素化檢測抗體之間的特異性識別，從而在磁珠上形成免疫夾心復合物。再添加HRP-鏈霉親和素溶液，由于鏈霉親和素和生物素之間的特殊親和力，HRP與免疫夾心結構結合。

其次，磁鐵捕捉磁珠免疫夾心復合物。將制備好的磁珠免疫夾心復合物溶液注入微流控腔室中，在微型電極的正下方放置磁鐵，得以捕捉免疫磁珠。

最后，加入底物溶液，開始電化學信號檢測。向微流控腔室中注入TMB/H?O?底物溶液，由于HRP在H?O?存在下的催化作用，TMB被氧化為TMB（Ox）。酶反應產(chǎn)物TMB（Ox）具有電活性，因此可以進行電化學檢測。待測物IL-6的濃度在一定時間內(nèi)與TMBox呈正相關。通過測量TMB（Ox）的還原電流，可以間接獲得IL-6的濃度。

構建ELISA磁珠免疫夾心結構

研究人員在96孔板中構建了ELISA磁珠免疫夾心結構，具體步驟如下：

1）將50ul捕獲抗體磁珠與40ul不同濃度的IL-6混合，4℃孵育過夜，并持續(xù)振蕩；

2）孵育后，在96孔板的底部放置磁鐵，捕捉IL-6結合的捕獲抗體磁珠；然后使用0.1% PBST洗滌三次，將未與磁珠結合的IL-6洗掉；

3）加入100ul生物素化的檢測抗體，37℃孵育1小時，在磁珠上形成免疫夾心結構；

4）0.1% PBST洗滌三次后，加入100ul HRP-鏈霉親和素復合物，37℃孵育30分鐘；

5）0.1% PBST洗滌五次后，加入40ul PBS重懸磁珠免疫夾心復合物，保存在4℃中備用。

圖2 磁珠上構建免疫夾心結構。

微流控電化學磁免疫傳感器性能測試

將上述備用的ELISA磁珠免疫夾心結構溶液注入微流控反應室中，并應用磁鐵捕捉電極表面的磁珠。隨后，將基質混合物TMB/H?O?轉移到微流控反應室中并孵育15分鐘，采用I-T法（0.8V，50s）檢測待測物濃度，線性范圍為0.97至250pg/mL，檢測限（LOD）為0.412pg/mL。測試結果如下圖所示。

圖3 （A）不同濃度IL-6的電流響應；（B）電化學磁免疫傳感器對IL-6的校準圖，插圖為電流與IL-6濃度對數(shù)之間的線性關系。

人血清樣本的電化學測量

為了研究微流控磁免疫傳感器在實際臨床應用中的可行性和有效性，研究人員對加入不同濃度IL-6的人血清樣本進行了測試。如下表所示，回收率在93.37%到103.84%之間，相對標準偏差小于10%。這一結果表明，該研究中的微流控電化學磁免疫傳感器具有較好的可靠性和精度。