一種雙CRISPR/Cas12a輔助的逆轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（RT-RAA）檢測方法

短時間內(nèi)進(jìn)行大量新冠病毒檢測是控制新冠病毒傳播的關(guān)鍵之一，發(fā)展可現(xiàn)場診斷的檢測設(shè)備有利于促進(jìn)新冠肺炎的早期干預(yù)和治療，并有效降低疾病傳播風(fēng)險。重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）以及重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（Recombinase aided amplification，RAA）因其快速、簡便、等溫而成為現(xiàn)場診斷的首選擴(kuò)增技術(shù)，但可能存在非特異性擴(kuò)增的假陽性問題。規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）具有良好的特異性和可靠性。RPA與CRISPR的結(jié)合可以兼具靈敏度和特異性，在開發(fā)下一代POCT分子診斷技術(shù)方面具有廣闊前景。然而，目前大多數(shù)CRISPR/Cas輔助RPA方法包含前擴(kuò)增子的轉(zhuǎn)移和多種人工操作，使測試過程復(fù)雜化，增加了污染風(fēng)險，而少數(shù)一鍋法的反應(yīng)又需要較長的反應(yīng)時間。

近期，南方科技大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種雙CRISPR/Cas12a輔助的逆轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（RT-RAA）檢測方法和“樣本進(jìn)-結(jié)果出”的離心微流控平臺，該平臺可在30min內(nèi)自動檢測1拷貝/μL的新冠病毒（SARS-CoV-2），具有一步、自動化、快速和靈敏的優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷和疾病預(yù)防方面具有重大潛力。相關(guān)研究成果以“Dual-CRISPR/Cas12a-Assisted RT-RAA for Ultrasensitive SARS-CoV?2 Detection on Automated Centrifugal Microfluidics”為題發(fā)表于Analytical Chemistry期刊。

該基于雙CRISPR/Cas12a輔助的RT-RAA的自動化微流控平臺操作流程和工作原理如圖1所示，RT-RAA和CRISPR/Cas12a試劑分別通過冷凍干燥的方式預(yù)裝入擴(kuò)增室和檢測室進(jìn)行長期保存。操作人員只需加入核酸樣品溶液，并將芯片放置在相應(yīng)的檢測儀器上，即可在30分鐘內(nèi)自動完成擴(kuò)增-檢測-報告流程。針對新冠病毒的E基因序列設(shè)計RT-RAA引物、Cas12a-crRNA序列，并引入標(biāo)記FAM和BHQ-1的單鏈核酸報告序列。由于兩個crRNA識別不同的位點(diǎn)，每個擴(kuò)增子都可以激活兩個CRISPR/Cas復(fù)合物，此雙活性復(fù)合物顯著提高了ssDNA-FQ報告基因的切割率，更有利于低濃度模板RNA的RT-RAA系統(tǒng)的檢測。

圖1 CRISPR/Cas12a輔助的RT-RAA的超敏檢測SARS-CoV-2的自動化離心微流控平臺

研究人員首先驗(yàn)證了基于雙CRISPR/Cas12a輔助的RT-RAA系統(tǒng)的可行性和靈敏度。引入CRISPR/Cas12后，可見空白組非特異性熒光信號明顯降低。相較于單一crRNA，雙crRNA策略的熒光信號最強(qiáng)，且實(shí)時熒光增長速度最高。此外，也通過凝膠電泳驗(yàn)證了雙crRNA策略的可行性，如圖2a所示，加入混合crRNA樣品后，不僅生成了片段-F和片段-R，還生成了最短的片段-M。接著，研究人員采用無需開蓋的一鍋法測定該法的靈敏度（將CRISPR/Cas12a體系放在蓋帽，RT-RAA體系放在管內(nèi)），熒光成像和測定結(jié)果如圖2b所示，該法可檢測到低至約10個拷貝的SARS-CoV-2的E基因。

圖2 雙CRISPR/Cas12a法靈敏快速檢測SARS-CoV-2

鑒于微流控平臺在微尺度流體自動控制方面的優(yōu)勢，該研究將雙CRISPR/Cas12a輔助的RT-RAA法引入微流控平臺（圖3）。該平臺由三層組裝而成，分別為注射層（1mm）、連接層（1mm）和反應(yīng)層（2mm）。其中，進(jìn)樣層上的8個進(jìn)樣孔（Φ=1mm）與移液管的20μL完美貼合，出樣孔（Φ=0.5mm）保證樣本量順利進(jìn)入樣品腔。連接層上的連接通道可以保持密封芯片內(nèi)樣品腔與預(yù)分配腔之間的壓力平衡。反應(yīng)層上的600μm寬通道可以保證樣品在低轉(zhuǎn)速800轉(zhuǎn)/分鐘時順利進(jìn)入放大腔。擴(kuò)增室與檢測室之間的100μm窄通道和毛細(xì)管閥可以防止低轉(zhuǎn)速下的樣品進(jìn)入檢測，只有在轉(zhuǎn)速達(dá)到3000轉(zhuǎn)/分鐘時才能使樣品進(jìn)入檢測室。該芯片可以同時進(jìn)行32項(xiàng)測試，只需要兩次樣品轉(zhuǎn)移和兩步反應(yīng)，可認(rèn)為是一種低成本、直接檢測的離心微流控平臺。圖4a-b顯示了該微流控平臺的采樣過程、檢測儀器和檢測流程。此外，采用不同顏色清晰地顯示不同階段的流動狀態(tài)，將CuSO?和海藻糖/聚蔗糖的混合物通過冷凍干燥的方式預(yù)加載到芯片中（圖4c）。當(dāng)以800轉(zhuǎn)/分鐘低速旋轉(zhuǎn)時，黃色酸性FeCl?溶液（代表目標(biāo)溶液）進(jìn)入擴(kuò)增室，變?yōu)榫G色，藍(lán)色檢測室表示無液體進(jìn)入檢測室。而當(dāng)轉(zhuǎn)速提高到3000轉(zhuǎn)/分鐘時，溶液進(jìn)入檢測室并變?yōu)榫G色，因此該芯片按照預(yù)期逐步完成樣品轉(zhuǎn)移。

圖3 離心微流控芯片的結(jié)構(gòu)

圖4 離心微流控芯片的結(jié)構(gòu)和自動化微流控平臺的工作流程

接著，研究人員對該微流控平臺的靈敏度進(jìn)行了考察，如圖5所示，該法的檢出限為1拷貝/μL。此外，對34份SARS-CoV-2臨床標(biāo)本（26例陽性，8例陰性）進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用，采用商用RT-qPCR作為金標(biāo)準(zhǔn)，增加Orf1ab基因?yàn)檠a(bǔ)充靶基因增加檢測的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示，對于閾值循環(huán)數(shù)（Ct）＜30的RT-qPCR檢測樣品，CRISPR檢測在10分鐘內(nèi)達(dá)到最大熒光信號，定義為“強(qiáng)陽性”樣品；Ct＞30的RT-PCR檢測樣品，CRISPR檢測在10分鐘后無法達(dá)到最大熒光，被定義為“弱陽性”樣品。因此，該雙CRISPR/Cas12a輔助RT-RAA微流控平臺提供了一種直接、快速、自動化的方法，有潛力開發(fā)用于SARS-CoV-2檢測的POCT診斷。

圖5 基于雙CRISPR/Cas12a輔助RT-RAA的自動微流控平臺上檢測SARS-CoV-2

綜上所述，該研究提供了一種基于雙CRISPR/Cas12a輔助RT-RAA微流控平臺方法，實(shí)現(xiàn)了SARS-CoV-2快速、現(xiàn)場、自動化、超靈敏的檢測要求，在開發(fā)下一代POCT分子診斷技術(shù)方面具有很大的潛力，可用于家庭或小型診所的傳染病快速檢測。為了實(shí)現(xiàn)更好的實(shí)際應(yīng)用，今后改進(jìn)和發(fā)展方向如下：（1）通過注射成型的方法制作微流控芯片，滿足定標(biāo)需求；（2）優(yōu)化冷凍干燥技術(shù)參數(shù)，延長芯片的存儲時間;（3）將檢測結(jié)果無線傳輸?shù)骄W(wǎng)站或報告服務(wù)器，實(shí)現(xiàn)簡單、快速、智能、互聯(lián)的疾病診斷和跟蹤;（4）同時檢測和鑒別其他病毒感染，以實(shí)現(xiàn)有效的疾病治療和管理等。

論文鏈接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c00638

審核編輯 ：李倩