引物和擴(kuò)增子設(shè)計(jì)對(duì)DNA擴(kuò)增成功有何影響

摘要 本文采用毛細(xì)管對(duì)流 PCR 平臺(tái)將毛細(xì)管安裝在溫度為 95°C 的加熱器上，通過(guò)自然對(duì)流實(shí)現(xiàn) PCR 循環(huán)。

毛細(xì)管底部(高溫區(qū)域) 樣品通過(guò)浮力驅(qū)動(dòng)上升，同時(shí)使模板變性。樣品上升過(guò)程中，因周圍空氣的冷卻使其溫度下降。

當(dāng)樣品到達(dá)毛細(xì)管頂部(低溫區(qū)域)時(shí)，開始進(jìn)行退火和延伸，隨后 DNA 模板下沉并再次加熱。

引物和擴(kuò)增子設(shè)計(jì)對(duì) DNA 擴(kuò)增成功與否至關(guān)重要。

術(shù)語(yǔ) CCPCR :Capillary Convective PCR

簡(jiǎn)介

由溫度梯度內(nèi)的流體密度變化引起的自然對(duì)流可用于 DNA 擴(kuò)增。當(dāng)樣品在自然對(duì)流作用下在不同溫度區(qū)域重復(fù)循環(huán)時(shí)，樣品可能會(huì)在一次循環(huán)中經(jīng)歷 PCR 擴(kuò)增的三個(gè)步驟----核酸變性，退火和延伸。

對(duì)流 PCR 可以將擴(kuò)增時(shí)間從數(shù)小時(shí)縮短至 30-40 分鐘。但是，當(dāng)前的對(duì)流 PCR 系統(tǒng)使用兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的溫度控制器和復(fù)雜的系統(tǒng)設(shè)計(jì)，需要特定形狀的管道或額外的腔室才能使流體完全循環(huán)。

此外，某些操作需要特定的技巧，如從細(xì)管中裝載和卸載試劑以及密封管的兩端而不將氣泡困在里面。每一步操作對(duì)成功擴(kuò)增都至關(guān)重要。

此外，因沒(méi)有研究對(duì)比傳統(tǒng) PCR 和對(duì)流 PCR 在引物和擴(kuò)增子設(shè)計(jì)上的差異，從而限制了對(duì)流 PCR 的廣泛應(yīng)用。

毛細(xì)管對(duì)流 PCR 平臺(tái)

如圖 1 所示，毛細(xì)管對(duì)流 PCR 采用帶有溫度反饋控制功能的熱浴鍋?zhàn)鳛闊嵩?。樣品容器為一種具有封閉式底部的商業(yè)玻璃毛細(xì)管 (100 ul)，長(zhǎng) 51 mm，其內(nèi)徑和外徑分別為 2.3 mm 和 3.2 mm。

將兩個(gè)具有不同鉆孔深度（4 mm 和 30 mm）的加熱塊放入溫度維持于 95°C 的熱浴鍋中。(有意思，也就是它的熱源是 水 唄)

首先將裝有樣品的玻璃毛細(xì)管放入 30 mm 深的加熱塊上。在 10 min 內(nèi)通過(guò)熱傳導(dǎo)將整個(gè)試管完全加熱以激活 Taq DNA 聚合酶。

之后，將管子轉(zhuǎn)移到 4 mm 深的加熱塊上，并采用塑料毛細(xì)管支架支撐。僅在底部加熱試管 30 min，便可進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。

圖 1 兩個(gè)加熱塊放置在 95° 的熱浴鍋中

樣品上部覆有10μL 礦物油。2ul 的 CPCR 產(chǎn)物采用 瓊脂糖凝膠電泳分析。

粒子圖像測(cè)速和溫度測(cè)量

通過(guò)粒子圖像測(cè)速技術(shù)(PIV) 對(duì)毛細(xì)管 (75ul) 中流體的流動(dòng)進(jìn)行了觀察。其中，h / d = 7.7 ( h / d 表示毛細(xì)管中樣品的高度與毛細(xì)管內(nèi)徑之比)。

試劑采用去離子水，直徑 50μm 的polystyrene polyamide particles 作為 trace particle (:1005 )。

預(yù)熱 10 min 后，采用 Nd：Yag 激光 ( λ= 532 nm ) 作為激發(fā)光，示蹤顆粒在 ?585 nm 處發(fā)熒光。圖像以每秒 15 幀的速率在 CCD 相機(jī)上被捕獲。

試劑和油之間的溫度（）采用溫度記錄儀測(cè)量。

結(jié)果與討論

如圖 2A 所示，在此平臺(tái)中，當(dāng)毛細(xì)管從下端加熱，上端被周圍的空氣冷卻時(shí)，試劑中產(chǎn)生的溫度梯度引起自然對(duì)流，使得試劑循環(huán)通過(guò) DNA 擴(kuò)增所需的熱梯度。

成功應(yīng)用此平臺(tái)有如下兩個(gè)挑戰(zhàn)： (1)當(dāng)只有一個(gè)溫度控制裝置時(shí)，需保證變性，退火和延伸所需流場(chǎng)和溫度場(chǎng)的穩(wěn)定性; (2)設(shè)計(jì)適合與平臺(tái)產(chǎn)生的溫度梯度一起使用的引物和擴(kuò)增子。

圖 2A

圖 1B (頂部) 顯示了從毛細(xì)管下端加熱，其內(nèi)部試劑循環(huán)一圈溫度的變化情況。(the hottest temperature) 位于毛細(xì)管底部，(the lowest temperature)位于毛細(xì)管上方 (油和試劑接觸的部分)。 為確保 PCR 擴(kuò)增的三個(gè)步驟發(fā)生在毛細(xì)管內(nèi)部，(擴(kuò)增子的變性溫度)應(yīng)低于，(引物的解鏈溫度；melting temperature of the primer)應(yīng)高于 。顯然，在變性/退火/延伸步驟中有效反應(yīng)的時(shí)間取決于溫度差：和 。 Primers with melting temperatures in the range of 52-58°C generally produce the best results.

圖 2B CCPCR (上圖) 和傳統(tǒng) PCR (下圖) 之間樣品溫度曲線的比較。傳統(tǒng) PCR 在每一步擴(kuò)增中都保持恒定的溫度，并且整個(gè)管中一次只能執(zhí)行一個(gè)擴(kuò)增步驟，而 CCPCR 的溫度曲線沿毛細(xì)管的長(zhǎng)度方向平滑變化，同時(shí) PCR 擴(kuò)增的不同步驟同時(shí)進(jìn)行。

為了延長(zhǎng)擴(kuò)增的持續(xù)時(shí)間，可以通過(guò)調(diào)節(jié)熱系統(tǒng)或通過(guò)設(shè)計(jì)具有高解鏈溫度的特異性引物來(lái)調(diào)節(jié)和 。 如圖 3 所示，采用不同體積的樣品測(cè)量了油和試劑接觸部分的溫度。結(jié)果表明，樣品體積越大，越低。理論上講，可以增加更多的樣本量來(lái)降低以提供更長(zhǎng)的有效擴(kuò)增時(shí)間。

圖 3 當(dāng)熱浴鍋溫度設(shè)定在95°C時(shí)，油-樣品區(qū)的溫度隨著樣品體積的增加而降低

但是，如果流體路徑過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)激發(fā)自然對(duì)流中的第二種運(yùn)動(dòng)模式：也就是說(shuō)，流動(dòng)模式可能會(huì)分成兩個(gè)或多個(gè)垂直循環(huán)路徑。對(duì)于更長(zhǎng)的毛細(xì)管，流體流動(dòng)可能會(huì)變得更加紊亂。 應(yīng)避免這些情況，以確保流體運(yùn)動(dòng)模式的穩(wěn)定性。進(jìn)一步，腔室體積變大會(huì)增加所需 PCR 試劑的量進(jìn)而增加反應(yīng)成本。因此，選擇了體積為 75μL 的毛細(xì)管來(lái)維持穩(wěn)定的熱對(duì)流環(huán)境。

圖 4 (I) 將底部厚度為 3mm 的商用玻璃毛細(xì)管放在具有直徑 3.2mm ，深 4mm 孔的鋁塊中加熱. (II) 一個(gè)塑料毛細(xì)管支架防止毛細(xì)管傾斜(支架高度(HH): 26 mm；礦物油: 10μL). (III)采用 PIV 進(jìn)行流場(chǎng)分析. (IV) FLUENT 模擬顯示當(dāng)樣品高度為 18 mm (體積為75μL) 時(shí)，毛細(xì)管中流場(chǎng)的穩(wěn)定循環(huán)狀況.

如圖 4 所示， 采用 PIV 可視化了毛細(xì)管 (直徑: 2.3 mm) 中的流體流動(dòng)情況，并通過(guò) FLUENT 仿真模擬軟件進(jìn)行了確認(rèn)。上述設(shè)計(jì)解決了流體流動(dòng)產(chǎn)生的第一個(gè)挑戰(zhàn)和成功擴(kuò)增所需的溫度場(chǎng)。

圖 5 h/d = 7.7, Ra = 時(shí)，毛細(xì)管對(duì)應(yīng)的溫度場(chǎng)和速度場(chǎng)分布. 對(duì)于第二個(gè)問(wèn)題，在固定溫度條件下(°C , °C)，引物的最佳值應(yīng)該被測(cè)試。本文設(shè)計(jì)了 7 個(gè)在 57–80°C 范圍內(nèi)具有不同的引物對(duì)，通過(guò)上述平臺(tái)擴(kuò)增 HBV。 如圖 6 凝膠電泳數(shù)據(jù)所示，CPCR不能使用≤ 70°C 的引物擴(kuò)增靶 DNA，但 ≥ 72°C 的引物卻可以成功擴(kuò)增靶 DNA。采用 ≥ 76°C 的引物，電泳 DNA 條帶的強(qiáng)度似乎更強(qiáng)。

圖 6

除了 之外，用于變性的 是影響 CPCR 擴(kuò)增的另一個(gè)因素。如果試管中的太接近，CPCR 將失敗，因?yàn)殡p鏈 DNA 不可能完全變性，這將不允許引物有效地退火至模板 DNA。這會(huì)降低平臺(tái)檢測(cè)長(zhǎng)擴(kuò)增子的能力，因?yàn)檩^長(zhǎng)的長(zhǎng)度或較高的 GC 含量通常會(huì)伴隨較高的變性溫度。 如圖 7I 所示，本文對(duì)范圍為 86–91°C 的四個(gè) HBV 擴(kuò)增子進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn) CPCR 可以在 < 87°C (??> 8°C) 的情況下擴(kuò)增兩個(gè)擴(kuò)增子 (122 和 169 bp)。 > 90°C 時(shí) (< 5°C) 擴(kuò)增其它兩個(gè)擴(kuò)增子 (188 和 222 bp)。為了增加???,可以將加熱溫度從 95 °C 調(diào)整為 99 °C。 在圖 7BII 中可得出，??> 90°C 時(shí)，188 和 222 bp 的擴(kuò)增子均出現(xiàn)弱帶，表明較大的值可以成功擴(kuò)增具有較高值的 DNA 模板。 應(yīng)當(dāng)注意，圖 7BII 中122 和169 bp 擴(kuò)增子的條帶均比圖 7BI 中的條帶弱。原因可能為，當(dāng) ≤ 86°C 時(shí)，這兩個(gè)擴(kuò)增子的引物退火效率會(huì)因油-試劑處溫度的升高而降低。

圖 7

也可以使用化學(xué)方法通過(guò)添加二甲基亞砜 (DMSO) 來(lái)降低擴(kuò)增子的 ，從而增強(qiáng) DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變性。但是，DMSO 也會(huì)影響模板上的引物退火，因?yàn)橐锏慕档?，在某些情況下可能會(huì)對(duì) CPCR 擴(kuò)增產(chǎn)生不利影響 (如圖 7BIII)。 保持相同的熱場(chǎng)(°C, °C) 對(duì)于在毛細(xì)管中保持一致的流場(chǎng)和溫度場(chǎng)分布很重要，而且如果可以選擇具有所需的擴(kuò)增子而不改變引物的會(huì)更好。 選擇低是擴(kuò)增長(zhǎng)擴(kuò)增子的策略，但存在加熱器溫度必須保持在 95°C 的限制。因此，本文嘗試使用 CPCR 擴(kuò)增 7 個(gè)不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增子，從 208 到 816 bp。

圖 8

如圖 8 所示，CPCR 可以擴(kuò)增 DNA≤500 bp 的長(zhǎng)度。這揭示了和在 CPCR 中的重要性，而傳統(tǒng) PCR 則更多地依賴于。 總之，對(duì)于任何 DNA 模板，CPCR的經(jīng)驗(yàn)法則是采用具有高的引物和低的擴(kuò)增子。 為了證明這一規(guī)則，如圖 9 所示，本文選擇了幾種 ≤500 bp (≤ 87°C，≥ 76°C ) 的不同病毒擴(kuò)增子進(jìn)行檢測(cè)，成功的實(shí)現(xiàn)全部擴(kuò)增。

圖 9

如圖 10 所示，HBV 質(zhì)粒DNA的測(cè)試靈敏度為每個(gè)反應(yīng) 30 份。高拷貝和低拷貝 HBV DNA 序列 (分別為 3000 和 3??????0??????拷貝/管) 僅在 30 分鐘內(nèi)通過(guò) CCPCR 擴(kuò)增。

圖 10 (上圖) 傳統(tǒng) PCR (圖片右半部分) 和 CCPCR (圖片左半部分) 擴(kuò)增從 到 3 的初始 DNA 拷貝數(shù)。傳統(tǒng) PCR 的總反應(yīng)時(shí)間為 1 小時(shí) 40 分鐘，CCPCR 為 30 分鐘。(下圖)使用高和低DNA濃度通過(guò) CCPCR 進(jìn)行擴(kuò)增的時(shí)間流程 (初始 DNA拷貝數(shù)：3000，左；30，右) 本文研究表明，這種簡(jiǎn)單的擴(kuò)增方法確實(shí)需要對(duì)擴(kuò)增子和引物 (高引物和低擴(kuò)增子) 進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以使其具有與傳統(tǒng) PCR 相當(dāng)?shù)男阅堋?這種優(yōu)化增加了和 的相對(duì)溫差，從而延長(zhǎng)了變性/退火/延伸反應(yīng)的空間和時(shí)間。

圖 11 毛細(xì)管對(duì)流 PCR 在不同環(huán)境溫度下的反應(yīng)。初始 DNA 拷貝為1000 份

一個(gè)主要的擔(dān)憂是環(huán)境溫度可能會(huì)對(duì) CPCR 產(chǎn)生影響，因?yàn)樵撈脚_(tái)使用環(huán)境溫度作為冷卻機(jī)制。 如圖 11 所示，本文測(cè)試發(fā)現(xiàn)，CPCR 在冰箱中 4°C 和暖箱中 33°C 均有效，但當(dāng)環(huán)境溫度 > 38°C 時(shí) CPCR 擴(kuò)增失敗。因此，除了極熱的地方外，CPCR 與一般的室內(nèi)操作兼容。

參考文獻(xiàn)

Rapid DNA amplification in a capillary tube by natural convection with a single isothermal heater.

編輯：黃飛