基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的紙基核酸快速檢測

核酸分子具有豐富的遺傳信息，對疾病診斷具有關(guān)鍵價值。傳統(tǒng)核酸檢測技術(shù)受限于耗時長、需大型儀器設(shè)備等局限，嚴重制約了其在大規(guī)模、突發(fā)性疾病檢測中的應(yīng)用。紙基微流控具有便攜、自驅(qū)動等優(yōu)勢，在整合等溫擴增技術(shù)后，為核酸分子快速、準確的檢測提供可能。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，來自重慶大學(xué)等科研機構(gòu)的研究人員，于《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》發(fā)表綜述文章，從紙基微流控的設(shè)計出發(fā)，總結(jié)了紙基微流控在核酸分子檢測中的研究進展，并分析了影響其檢測靈敏度、穩(wěn)定性等的干擾因素，為推動紙基微流控向臨床轉(zhuǎn)化提供重要參考。

圖1 基于紙基微流控的核酸檢測技術(shù)

基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）的紙基核酸快速檢測

LAMP體系中Mg2?、焦磷酸等副產(chǎn)物的變化常被作為核酸檢測依據(jù)。為與紙基微流控更好地整合，基于體系中Mg2?的濃度變化，有研究人員利用多層紙基材料進行3D組裝，結(jié)合蠟染技術(shù)構(gòu)建了多個具有縱向流體空間的LAMP反應(yīng)區(qū)（圖2A），僅需一步加樣，即可通過Mg2?敏感染料羥基萘酚藍的熒光特性對LAMP信號進行實時分析。此外，利用LAMP擴增過程中能產(chǎn)生大量焦磷酸，導(dǎo)致反應(yīng)體系的pH發(fā)生明顯改變這一特點的紙基pH指示法，已在寨卡病毒等檢測中被證明具有較高靈敏度，檢測限低至1拷貝/μL。除了利用LAMP反應(yīng)體系本身的特性變化作為檢測依據(jù)外，其他報道的紙基LAMP信號輸出方法還包括底物顯色、熒光標記和基于流體層析距離（圖2B）的檢測等。然而，上述研究大多依靠單獨的擴增步驟。為將擴增與檢測整合于一體，有研究人員設(shè)計了一種瘧疾檢測POCT裝置（圖2C），并通過整合一個多功能3D紙帶進行臨床血液樣本的擴增前預(yù)處理；經(jīng)LAMP反應(yīng)后，靶標能繼續(xù)與通道中預(yù)儲存的紅色微球結(jié)合，隨后在2D紙基微流控上完成檢測，實現(xiàn)了擴增與檢測一體化。

圖2 基于LAMP技術(shù)的紙基核酸快速檢測

基于重組酶聚合酶擴增（RPA）的紙基核酸快速檢測

與LAMP相比，RPA技術(shù)能夠在37℃的室溫條件下在20mi內(nèi)實現(xiàn)靶核苷酸的高效常溫擴增。由于RPA具有相對較低的最適擴增溫度，因此在選擇疏水區(qū)構(gòu)建方法時無須考慮反應(yīng)溫度對疏水材料的影響，便于直接在紙基微流控上實現(xiàn)擴增與檢測一體化。

基于雜交鏈式反應(yīng)（HCR）的紙基核酸快速檢測

HCR是一種無酶核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)的提出使得核酸分子的體外擴增擺脫了對聚合酶的依賴，進一步降低了紙基核酸快速檢測裝置的生產(chǎn)、存儲成本。目前，已有相關(guān)研究利用HCR反應(yīng)設(shè)計了一種能更高效檢測沙門菌的紙基微流控芯片（圖3A）。此外，有研究人員在基于HCR反應(yīng)的同時巧妙地利用了紙張的咖啡環(huán)效應(yīng)作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)手段（圖3B），將體系中液體的蒸發(fā)過程轉(zhuǎn)化為紙張末端彩色條帶的形成過程，僅需測量著色帶長度即可對miRNA-21進行定量，檢測限為0.2pmol/L，為提高檢測靈敏度提供了新思路。

圖3 基于HCR 技術(shù)的紙基核酸快速檢測

基于催化發(fā)卡自組裝反應(yīng)（CHA）的紙基核酸快速檢測

CHA是在HCR技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的一種更高效、更靈敏的無酶信號放大技術(shù)。CHA與HCR的主要區(qū)別在于，CHA反應(yīng)中靶標觸發(fā)級聯(lián)放大效應(yīng)后并不會作為生成物的一部分參與后續(xù)延伸，而是會被重新釋放到體系中充當“催化劑”繼續(xù)觸發(fā)下一段CHA反應(yīng)，產(chǎn)生更明顯的信號放大效果。無酶催化的CHA具有更高靈敏度和放大效率，在紙基微流控中是一種同樣經(jīng)濟且更適用于微量靶標的檢測手段。

基于CHA反應(yīng)強大的信號放大效果，研究人員開發(fā)了一種能夠在紙質(zhì)芯片上具有雙重放大能力的早期胰腺癌診斷卡（圖4A）。與傳統(tǒng)的免疫分析試紙條相比，該設(shè)計通過同時引入CHA和金沉積手段達到更高的檢測靈敏度。為了縮短反應(yīng)時間、提高檢測效率，研究人員進一步將該技術(shù)進行了拓展：在靶標觸發(fā)CHA反應(yīng)后，分別利用量子點和多色熒光基團標記取代了金增強步驟（圖4B-C），實現(xiàn)對miRNA-21和丙型肝炎病毒精確定量的同時將反應(yīng)時間縮短至原來的1/3。

圖4 基于CHA技術(shù)的紙基核酸快速檢測

總體而言，紙基微流控技術(shù)自21世紀初研發(fā)以來取得了巨大進步，已成為臨床POCT領(lǐng)域的重要組成部分。隨著研究的深入，其在核酸快速檢測領(lǐng)域的檢測靈敏度、功能集成度等方面取得了較大突破；加之便攜式信號分析設(shè)備開發(fā)以及機器學(xué)習(xí)等算法的引入正在逐步提高紙基微流控在核酸檢測中的定量分析能力，并逐步向智能化、通用化邁進。近年來系列核酸等溫擴增技術(shù)被相繼開發(fā)后，核酸擴增擺脫了梯度溫控設(shè)備的限制，紙基微流控核酸檢測技術(shù)也因此迎來了高速發(fā)展。但用于核酸檢測的紙基微流控裝置在進行臨床或復(fù)雜環(huán)境下的評估之前，必須在實驗室進行大量的測試和改良工作，以應(yīng)對真實應(yīng)用場景下可能出現(xiàn)的各種問題。此外，將核酸檢測涉及的多個樣本預(yù)處理步驟集成在紙質(zhì)設(shè)備中，將難以避免地提升裝置的復(fù)雜程度，在此情況下如何同時方便用戶使用的問題也不容忽視。

審核編輯：郭婷