微流控耦合高分辨質(zhì)譜技術(shù)檢測單個細胞內(nèi)代謝物

代謝物是生化調(diào)控的最終產(chǎn)物，可以實時準確地表征細胞的生化表型。由于細胞的異質(zhì)性和某些代謝物的快速周轉(zhuǎn)，傳統(tǒng)的檢測大量細胞的方法無法準確反映單個細胞的情況，因此對單個細胞內(nèi)代謝物的檢測越來越有必要。

單細胞代謝組學可以直接獲得單個細胞的代謝物信息，從而深入了解單個細胞的生理行為與其化學成分之間的關(guān)系。對于分子生物學研究和實際臨床應(yīng)用來說，需要在短時間內(nèi)對大量的單個細胞進行分析。因此，迫切需要高通量單細胞分析方法。

基于此，中國科學院大連化物所許國旺研究團隊運用單細胞代謝組學開發(fā)了一種新型的非對稱蛇形通道微流控芯片，一次性能分析3000多個單細胞，可運用于哺乳動物腫瘤細胞酵母細胞分析。相關(guān)成果以“High-throughput single cell metabolomics and cellular heterogeneity exploration by inertial microfluidics coupled with pulsed electric field-induced electrospray ionization-high resolution mass spectrometry”為題，發(fā)表于Analytica chimica acta期刊。

?

為了實現(xiàn)高通量分析，需要進行細胞分離和聚焦，以確保單個細胞逐個引入質(zhì)譜儀。目前還沒有一種方法可以在一次實驗中分析數(shù)千個細胞，而分析大量的細胞對于獲得有生物學意義的數(shù)據(jù)是非常重要的。

因此，研究人員開發(fā)了一種新型的非對稱蛇形通道微流控芯片，結(jié)合脈沖電場誘導電噴霧電離-高分辨質(zhì)譜（PEF-ESI-HRMS）方法，用于近生理條件下的高通量單細胞分析，一次實驗可分析3000多個單細胞。在腫瘤細胞中，大約有120種代謝物被注釋，并且根據(jù)單個細胞代謝譜成功區(qū)分了兩種不同的腫瘤細胞（MCF7和HepG2細胞）。

非對稱蛇形微流控芯片的設(shè)計

為了實現(xiàn)高通量分析，在MS分析之前加入細胞分離和聚焦系統(tǒng)是必不可少的。微流控中的慣性聚焦可以在不使用鞘液或其他外場的情況下實現(xiàn)細胞的精確橫向平衡位置控制和細胞間距的調(diào)節(jié)。使用這種無鞘細胞聚焦方法，細胞中的代謝物不會被過度稀釋，從而可以擴大代謝物的檢測范圍，是一種很有前途的單細胞大規(guī)模細胞儀的進樣方法。

研究人員設(shè)計了一種具有不對稱蛇形通道的微流控芯片，它由15個重復的S形單元和一個相連的直通道組成（圖1a）。入口區(qū)域的微通道被加寬，以減少細胞表面的法向應(yīng)力和剪切應(yīng)力。模擬測試結(jié)果表明，微流控芯片對哺乳動物癌細胞具有分散和聚焦作用。

圖1 非對稱蛇形微流控芯片的設(shè)計：（a）蛇形水道的幾何示意圖；（b）第8個大彎道和第9個小彎道斷面二次流分布及矢量；（c）4s后相同直徑細胞的流線。

PEF-ESI-HRMS芯片的配置和性能

PEF-ESI-HRMS芯片包含四個部分：用于輸送細胞懸浮液的注射泵、用于分散和聚焦細胞的不對稱蛇形通道微流控芯片、PEF-ESI源和Q Exactive HF質(zhì)譜儀。為了保持細胞活力和完整性，將細胞懸浮在碳酸氫銨等滲溶液中。通過注射泵將細胞懸浮液注入微流控芯片，然后通過不對稱微通道分散和聚焦細胞。當有序的單細胞到達納米噴霧發(fā)射器的尖端，電源產(chǎn)生的高壓方波脈沖將細胞分裂。最后細胞內(nèi)容物被立即釋放并被離子化，然后通過質(zhì)譜儀進行分析，從而獲得單個活細胞中代謝物的信息。

為了評估PEF-ESI-HRMS芯片的性能，將兩種癌細胞系（MCF7和HepG2）的細胞懸液引入系統(tǒng)。如總離子色譜圖（TIC）所示（圖2a），當細胞懸浮液流動時，獲得了單個細胞的脈沖樣信號。m/z 184.0733處的峰是磷酸膽堿，這是一種主要存在于細胞質(zhì)中的重要代謝物，該信號的出現(xiàn)代表細胞的破壞，因此被用作單細胞質(zhì)譜的標記。

磷酸膽堿的EIC（圖2b）與TIC具有良好的一致性，表明脈沖電場誘導的ESI源具有實現(xiàn)細胞碎裂和代謝物電離的能力。從MCF7（圖2c）和HepG2（圖2d）兩種不同的單細胞代謝譜中，可以觀察到HepG2肝癌細胞中代謝物的總體相對豐度較高。

圖2 采用PEF-ESI-HRMS分析MCF7和HepG2細胞系組成的不同細胞懸液。

需要注意的是，高濃度細胞懸浮液中粒子間相互作用會限制聚焦程度。細胞懸液的流速和濃度是影響單細胞質(zhì)譜的兩個重要因素。研究人員研究了不同的流速以優(yōu)化分析通量并提高系統(tǒng)穩(wěn)定性。綜合考慮微流控芯片接口所能承受的壓力和最大分析通量后，選擇1μL/min為合適流速。

為了適配這種相對較高的注入流速，在納米電噴霧發(fā)射器中施加幅度為5kV Vpp和頻率為200Hz的方波電壓。另外，以1μL/min優(yōu)化細胞懸浮液的濃度，結(jié)果如圖3b所示。單位時間內(nèi)單細胞MS信號的數(shù)量隨著細胞濃度的增加而增加，并且它們之間存在線性相關(guān)性。如圖3c所示，以1μL/min的流速和濃度為8 × 10?個細胞/mL的MCF7細胞懸浮液，最大通量可達到約80個細胞/min。與之前報道的方法相比，該方法得到的數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定。

圖3 HepG2和MCF7細胞懸液流速和細胞濃度對單細胞MS分析的影響。

提取每個脈沖峰最高點的質(zhì)譜信息，用于進一步的數(shù)據(jù)處理和分析。使用基于PEF-ESI-HRMS芯片的技術(shù)，可以從單個細胞中檢測到900多個特征峰，從群體細胞的LC-MS分析結(jié)果獲得的精確質(zhì)量和二級質(zhì)譜，可以鑒定出120種代謝物。對這些代謝物按照其化學特性進行分類，包括大多數(shù)重要的功能性代謝物，如氨基酸、?；鈮A、羧酸及其衍生物或類似物（圖3d）。

為了盡可能地保持細胞處于天然狀態(tài)，使用等滲鹽溶液作為萃取溶劑，所以檢測到的代謝物主要是水溶性好的極性代謝物。總的來說，基于PEF-ESI-HRMS芯片的質(zhì)譜流式細胞儀不僅展示出高通量，而且對極性代謝物檢測的覆蓋率也很高。此外，測試了儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性，連續(xù)運行約3小時，仍然可以獲得穩(wěn)定的質(zhì)譜信號，而不會堵塞微通道或納米噴霧發(fā)射器。

PEF-ESI-HRMS芯片在單個哺乳動物細胞高通量分析中的實際應(yīng)用

使用超過3000個HepG2細胞和MCF7細胞進行單細胞代謝檢測分析，并使用每種類型的1000個細胞的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行進一步分析，來證明這種高通量方法區(qū)分各種癌細胞的實用性。根據(jù)PCA圖可以很好地區(qū)分這兩種類型的細胞（圖4a）。

基于機器學習的t-SNE和UMAP算法被用于挖掘和可視化復雜的單細胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)。可以清楚地觀察到MCF7和HepG2細胞的分離，并揭示了兩種癌細胞顯著的代謝異質(zhì)性。云雨圖為了識別區(qū)分這兩種癌細胞的潛在生物標志物并評估它們的性能，進行了ROC分析。

結(jié)果表明這些代謝物可以作為區(qū)分MCF7和HepG2細胞的生物標志物。然后研究人員使用無監(jiān)督學習算法孤立森林來檢測同種細胞中的異常值，結(jié)果在1000個HepG2細胞中發(fā)現(xiàn)了32個潛在異常值（圖4c）。非異常值的HepG2細胞在PCA圖中得到了很好的聚類，進一步證明了該技術(shù)在分析大規(guī)模單細胞樣品時良好的穩(wěn)定性。

總體而言，HepG2細胞異常細胞中的代謝物含量高于非異常細胞（圖4d）。同樣地，鑒定了1000個MCF7細胞中的61個潛在異常值，結(jié)果如圖4e所示。與能量代謝密切相關(guān)的幾種關(guān)鍵代謝物在異常MCF7細胞中的含量相對較高（圖4f）?；谝陨辖Y(jié)果，異質(zhì)性細胞的概率約為5%，表明該技術(shù)具有探索細胞代謝異質(zhì)性的潛力。

圖4 PEF-ESI-HRMS芯片在單個哺乳動物細胞高通量分析：（a）基于單個HepG2和MCF7細胞的前兩個主成分的PCA圖；（b）MCF7和HepG2單細胞中亮氨酸和肌酸相對含量的云雨圖云雨圖；（c）HepG2細胞中的異常值；（d）HepG2細胞的異常值和非異常值中γ -氨基丁酸和氨基丙酮相對含量的云雨圖；（e）MCF7細胞的異常值；（f）MCF7細胞異常值和非異常值纈氨酸和磷酸相對含量的修正云雨圖。

在單個酵母細胞代謝譜分析中的實際應(yīng)用

為了證明該技術(shù)對有細胞壁的細胞也具有破壞能力，使用釀酒酵母作為模型細胞進行實驗。這類酵母細胞的細胞壁具有彈性結(jié)構(gòu)，常規(guī)代謝組學會使用酶解法、研磨法和超聲波法破壞酵母細胞壁，但這些方法都不適合單酵母分析。有研究表明，脈沖電場可以破壞酵母細胞壁，因此研究人員使用方波高壓脈沖使細胞快速被電傳孔，釋放出代謝物并被電離。

從單個酵母細胞中獲得的鳥氨酸、肌氨酸和賴氨酸的TIC和EICs（圖5a和5b）。在正離子模式下從單個酵母細胞中檢測到40多種代謝物，說明了該方法在具有細胞壁的單細胞代謝組學中的潛在應(yīng)用。

圖5 單個酵母細胞代謝譜分析：（a）分析單個酵母細胞的裝置示意圖；（b）單個酵母細胞中獲得鳥氨酸、肌氨酸和賴氨酸的TIC和EICs圖。

總之，研究人員建立了一種通用的基于PEF-ESI-HRMS芯片的方法，用于在接近生理條件下進行高通量單細胞代謝組學分析。PEF-ESI-HRMS芯片與慣性微流控裝置的新型組合在提供更高的分析通量和穩(wěn)定的電噴霧方面具有顯著優(yōu)勢，并保持高分析靈敏度。

1分鐘內(nèi)可完成80個癌細胞的分析，從單個HepG2或MCF7細胞中提取900多個特征峰，初步鑒定出120個代謝物，通過這種高通量方法實現(xiàn)了對這兩種癌細胞系的區(qū)分。

此外，通過孤立森林算法進一步識別了同類細胞內(nèi)的代謝異常值，說明該方法具有鑒別代謝異質(zhì)性細胞的潛力。該方法具有良好的分析穩(wěn)定性，可以在一次實驗中連續(xù)分析3000多個細胞。除此之外，PEF-ESI電離源還具有破碎有細胞壁的細胞如酵母的能力，并進行分析。

因此，該技術(shù)有望為新一代高通量質(zhì)譜流式細胞儀提供靈感，并為大規(guī)模單細胞代謝組學分析發(fā)揮加速作用，以幫助生物科學和臨床研究。

審核編輯：劉清