基于SCNL的方法用于特異性結(jié)合和檢測表面過表達(dá)SA分子的癌細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是腫瘤診斷和監(jiān)測的重要生物標(biāo)志物。然而，因?yàn)樗鼈兊南∮行?，CTCs的檢測仍然具有挑戰(zhàn)性，大多數(shù)的檢測方法都因CTCs在預(yù)富集步驟的丟失和缺乏捕獲不同類型癌細(xì)胞的通用抗體而受到限制。目前，CTCs分析通?；趦刹焦ぷ髁鞒?，包括CTCs富集和CTCs檢測。在富集過程中，血液中的CTCs可通過物理性質(zhì)或者生化性質(zhì)被捕獲。細(xì)胞的物理性質(zhì)如大小、電荷或彈性可被用于富集CTCs。物理富集方法雖然有效，但往往復(fù)雜，并且不能避免CTCs的丟失。此外，物理富集過程中處理時間長、液體流速高也可能破壞細(xì)胞膜的完整性，影響CTCs的下游分析。另一方面，生物化學(xué)方法可以通過靶向腫瘤特異性標(biāo)記物的抗體，例如細(xì)胞角蛋白（CK）、上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）、表皮生長因子受體（EGFR）、人表皮生長因子受體-2（HER-2）等，直接分離和檢測CTCs。然而，由于癌細(xì)胞的異質(zhì)性，其表面缺乏通用抗原，大多數(shù)基于免疫親和性的方法僅限于特定的癌癥類型或亞型，特別是轉(zhuǎn)移相關(guān)的間質(zhì)型CTCs，很難被常用抗體檢測到。因此，需要迫切開發(fā)出適用于廣譜癌癥類型和亞型的高敏感和特異性的CTCs檢測方法，以適應(yīng)CTCs的臨床應(yīng)用。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，香港城市大學(xué)楊夢甦教授課題組聯(lián)合深圳灣實(shí)驗(yàn)室崔淼博士報道了一種包含動態(tài)配體的雙重刺激響應(yīng)單鏈納米鎖（SCNL）聚合物探針，它具有高靈敏度和選擇性，可以與過表達(dá)唾液酸（SA）的廣譜腫瘤細(xì)胞和CTCs結(jié)合。這種高靈敏度是通過聚合物的單鏈結(jié)構(gòu)和多價功能基團(tuán)實(shí)現(xiàn)的，提高了靶細(xì)胞與SCNL之間相互作用的可及性和結(jié)合穩(wěn)定性。腫瘤細(xì)胞的靶向高選擇性是通過動態(tài)和雙重刺激響應(yīng)的納米鎖結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的，它可以在同時暴露于過表達(dá)的SA和腫瘤酸性微環(huán)境中解鎖并功能化。除了用于CTCs計(jì)數(shù)，SCNL方法還可以通過監(jiān)測腫瘤細(xì)胞表面SA的表達(dá)水平，來實(shí)現(xiàn)針對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的評估。

功能化單鏈納米鎖（SCNL）直接檢測腫瘤細(xì)胞和評估癌癥轉(zhuǎn)移的原理示意圖（來源：Biosens. Bioelectron.）

具體來看，這項(xiàng)研究采用動態(tài)結(jié)合策略，設(shè)計(jì)了一種具有鎖結(jié)構(gòu)的功能化單鏈納米探針，可在酸性微環(huán)境及過量表達(dá)的唾液酸（SA）雙重刺激下動態(tài)打開并與腫瘤細(xì)胞相結(jié)合。當(dāng)SCNL遇到腫瘤細(xì)胞時，腫瘤細(xì)胞周圍的酸性微環(huán)境會刺激嵌段單鏈聚合物（block single chain polymer）與PEG-Glu保護(hù)基團(tuán)之間的預(yù)結(jié)合解離，因此保證了SCNL對腫瘤細(xì)胞的檢測特異性。在酸性微環(huán)境下解鎖后，由于SCNL上的苯硼酸官能團(tuán)（PBA）可與SA同時形成共價鍵和配位鍵，與葡萄糖相比，解鎖后的SCNL（uSCNL）會主要與腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)的SA分子結(jié)合。此外，保護(hù)基團(tuán)上的PEG片段也有助于減少單核吞噬細(xì)胞對SCNL的識別和吸收，從而進(jìn)一步提高了腫瘤細(xì)胞檢測的特異性。綜上，柔軟的單鏈鎖結(jié)構(gòu)有利于SCNL對腫瘤細(xì)胞的逐步協(xié)同識別。這種單鏈層面上的分級識別進(jìn)一步保證了SCNL與CTCs之間的結(jié)合效率和準(zhǔn)確性。

功能化單鏈納米鎖（SCNL）的制備與表征

（來源：Biosens. Bioelectron.）

本項(xiàng)研究以S，S ‘-雙（ɑ’ɑ‘-二甲基-ɑ“-醋酸丙炔基）三硫代碳酸酯（BDPT）為對稱鏈轉(zhuǎn)移劑（CTA），通過催化可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合反應(yīng)生成ABA型嵌段單鏈聚合物。首先將N，N-二甲基丙烯酰胺（DMA）與丙烯酸-苯基硼酸（acrylate-PBA）共聚形成PBA-大分子CTA（PBA-macro-CTA）作為第一個A嵌段。A嵌段中的共聚丙烯酸酯-PBA促進(jìn)了單個聚合物鏈上多價PBA官能團(tuán)的形成，與使用單價PBA修飾方法相比，可以顯著提高單鏈納米凝膠探針與癌細(xì)胞的結(jié)合親和性。在第二步B嵌段的聚合中，DMA被引入做為單體并進(jìn)行聚合，為兩端鏈尾端帶有PBA官能團(tuán)的A嵌段增加一個柔軟靈活的連接部分。中間polyDMA嵌段的靈活性可以有效地促進(jìn)功能性PBA基團(tuán)向癌細(xì)胞表面的唾液酸（SA）基團(tuán)呈遞，最終促成癌細(xì)胞與嵌段單鏈聚合物的結(jié)合。以上得到的嵌段單鏈聚合物會繼續(xù)用Cyanine 3（Cy3）熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，并與聚乙二醇修飾的葡萄糖保護(hù)基團(tuán)結(jié)合形成最終的工作探針SCNL。工作探針SCNL的制備過程，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是通過凝膠滲透色譜、紫外吸收光譜、核磁共振（1H NMR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、動態(tài)光散射（DLS）及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT）來進(jìn)行驗(yàn)證的。

功能化單鏈納米鎖（SCNL）用于檢測不同類型的腫瘤細(xì)胞（來源：Biosens. Bioelectron.）

研究首先使用Cy3標(biāo)記的SCNL來鑒別不同SA表達(dá)水平的Hela細(xì)胞、HepG-2細(xì)胞和A549細(xì)胞與正常對照細(xì)胞間的信號差異。從共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）的結(jié)果來看，三種癌細(xì)胞經(jīng)SCNL探針孵育后，細(xì)胞膜上的熒光強(qiáng)度均顯著增加。SCNL孵育后的Hela細(xì)胞信號的顯著增加表明，與之前報道的其他基于PBA的探針相比，SCNL探針具有更高的靈敏度和標(biāo)記效率。此外，研究繼續(xù)利用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡技術(shù)證實(shí)了SCNL探針對Hela、HepG-2、A549、H1299、H4006、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系的靶向能力，進(jìn)一步驗(yàn)證了SCNL檢測不同類型腫瘤的普遍適用性。

功能化單鏈納米鎖（SCNL）用于檢測模擬樣本和臨床樣品中的CTCs（來源：Biosens. Bioelectron.）

而后，研究進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于3例健康人和5例非小細(xì)胞肺癌患者的臨床樣本CTCs檢測中。其中，健康人群的血液樣本中只檢測到極低的CTCs水平（《3 CTCs/mL）。但所有5例患者的樣本均檢測到具有顯著個數(shù)的CTCs，這證實(shí)了SCNL探針的樣本高檢出率。為了進(jìn)一步驗(yàn)證檢測方法的準(zhǔn)確性，研究將同一個人的血液樣本中基于SCNL的CTCs的檢測結(jié)果與基于EpCAM抗體和CD-45抗體的免疫熒光染色方法的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較?？贵w法和SCNL探針法檢測到的CTCs數(shù)量水平相似，驗(yàn)證了SCNL探針在CTCs臨床樣本檢測中的準(zhǔn)確性和適用性。

綜上所述，該研究開發(fā)了一種基于SCNL的方法，用于特異性結(jié)合和檢測表面過表達(dá)SA分子的癌細(xì)胞。通過識別癌細(xì)胞周圍的酸性微環(huán)境和癌細(xì)胞表面過表達(dá)的SA分子，動態(tài)PEG-Glu保護(hù)基團(tuán)和PBA-SA識別機(jī)制保證了SCNL探針對癌細(xì)胞的特異性靶向作用。其設(shè)計(jì)原理和結(jié)合機(jī)制使功能化SCNL探針對CTCs具有較高的檢出率。由于SCNL探針在癌細(xì)胞表面具有較高的穩(wěn)定性、靈活性和標(biāo)記密度，對于SA表達(dá)相對較低的Hela細(xì)胞，SCNL方法也表現(xiàn)出較高的敏感性和選擇性。同時，SCNL探針還顯示出對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移風(fēng)險進(jìn)行評估的潛能來預(yù)測腫瘤的惡性程度。該方法可與微流控技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高通量和床旁檢測，以滿足精準(zhǔn)醫(yī)療的要求。此外，這項(xiàng)工作還可能激發(fā)新一代單鏈納米探針的開發(fā)，用于如癌癥轉(zhuǎn)移和其他糖蛋白相關(guān)疾病的臨床檢測。