全光纖傳輸光度測(cè)量系統(tǒng)獨(dú)特的功能

與傳統(tǒng)的大腦成像技術(shù)相比，光纖光度法越來(lái)越受歡迎，它可以更好地掌握大腦的內(nèi)部運(yùn)作。隨著方法的不斷改進(jìn)，這是一個(gè)新技術(shù)的開始。

圖 1. 多通道光纖光度測(cè)量系統(tǒng)（photometry system）的構(gòu)建。488nm 激光器的光束通過(guò)物鏡同時(shí)耦合到一系列多模光纖中。然后發(fā)射的熒光由同一組光纖收集并由 sCMOS 相機(jī) (a) 檢測(cè)。雙通道模式 (b) 和四通道模式 (c) 的 sCMOS 相機(jī)上的光纖端面。

對(duì)大腦復(fù)雜性的全面、完整的理解仍然難以捉摸。揭開它的奧秘是了解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵——從阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s）和癡呆癥（dementia）到癲癇（epilepsy）和多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis）——以及更有效地治療甚至治愈它們的能力。

長(zhǎng)期依賴的非侵入性成像技術(shù)（non-invasive imagingtechniques），如 MRI 和 CT 掃描提供了對(duì)大腦內(nèi)部的觀察條件，但使用光纖的方法顯示出更為良好的效果，尤其是光纖光度法（fiber photometry）。

光纖光度法是一種用于研究神經(jīng)回路的光學(xué)成像技術(shù)，最初由慕尼黑路德維希馬克西米利安大學(xué)（Ludwig Maximilian Universityof Munich）的一個(gè)團(tuán)隊(duì)于 2005 年開發(fā)，用于記錄新生小鼠靜息時(shí)的皮質(zhì)（大腦外層the outer layer of the cerebrum）鈣離子波(Ca2+) 。它涉及將光纖植入大腦，以觀察和記錄大腦不同區(qū)域內(nèi)特定類型細(xì)胞的神經(jīng)元群體水平（population-level）的 Ca2+ 活動(dòng)。在大腦中，鈣活動(dòng)是控制突觸運(yùn)動(dòng)和記憶形成等活動(dòng)的核心。

與基因編碼（genetically encoded）的鈣指示劑（calcium indicators）結(jié)合使用，纖維光度法可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)活動(dòng)。

“纖維光度法提供了一種獨(dú)特的功能，可以輕松穩(wěn)定地記錄自由活動(dòng)動(dòng)物中具有細(xì)胞類型特異性的種群活動(dòng)，” 華中科技大學(xué)的Ruonan Fan 博士說(shuō)。她在華中武漢光電子國(guó)家實(shí)驗(yàn)室助理主任、布里頓機(jī)會(huì)生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)中心首席研究員傅玲領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室工作。

不斷增長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)

雖然低時(shí)間和空間分辨率是一個(gè)顯著的挑戰(zhàn)，但光度法仍然是優(yōu)于其他鈣成像技術(shù)（如單光子或雙光子顯微鏡）的首選方法。光纖更容易植入，重量也更輕，允許受試者自由移動(dòng)和執(zhí)行自然行為，這也是該技術(shù)的關(guān)鍵。光纖光度法也更能抵抗電磁干擾，更有效地收集數(shù)據(jù)，并且迄今為止已被證明對(duì)于長(zhǎng)期神經(jīng)監(jiān)測(cè)更穩(wěn)定。

“它已成為神經(jīng)科學(xué)中一種廣泛使用的光學(xué)方法，”范博士提到，并引用了 Fu 教授團(tuán)隊(duì)在 2015 年開發(fā)的可擴(kuò)展多通道光纖光度測(cè)量系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以同時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物甚至不同動(dòng)物的多個(gè)大腦區(qū)域的神經(jīng)活動(dòng)。

Fu 實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)導(dǎo)的另一項(xiàng)研究涉及在 2019 年開發(fā)特定于軸突末端的多通道光纖光度計(jì)。研究小組在研究中解釋說(shuō)，軸突主要通過(guò)其末端的突觸將信息從一個(gè)神經(jīng)元傳輸?shù)搅硪粋€(gè)神經(jīng)元，并且“從自由移動(dòng)動(dòng)物的軸突末端記錄是了解動(dòng)物行為過(guò)程中信息處理的重要步驟?！?/p>

現(xiàn)在，由 Fu 團(tuán)隊(duì)領(lǐng)導(dǎo)的正在進(jìn)行的研究（今年 5 月首次發(fā)表）在傳統(tǒng)技術(shù)的基礎(chǔ)上提供了更多優(yōu)勢(shì)。

“我們開發(fā)了一種兼容且靈活的全光纖傳輸光度測(cè)量系統(tǒng)，”范說(shuō)?！拔覀兛梢酝瑫r(shí)實(shí)現(xiàn)光遺傳學(xué)操作和神經(jīng)元活動(dòng)的多色記錄以及自由移動(dòng)（neuronal activities）動(dòng)物的神經(jīng)遞質(zhì)釋放（neurotransmitter release）?！?/p>

該團(tuán)隊(duì)一直在研究在動(dòng)物行為期間以細(xì)胞類型特異性和精確的時(shí)空分辨率來(lái)操縱和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)?！斑@些是探索體內(nèi)神經(jīng)回路的功能連接、信息傳遞和生理功能的基礎(chǔ)技術(shù)，”范說(shuō)。

新的全光纖傳輸光度測(cè)量系統(tǒng)基于多分支光纖束（圖 1）。它允許在自由移動(dòng)的動(dòng)物中同時(shí)進(jìn)行光遺傳學(xué)操作和多色記錄神經(jīng)元 Ca2+（或神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)）。

“這是對(duì)當(dāng)前光纖光度測(cè)量系統(tǒng)的有效補(bǔ)充，”范說(shuō)。

新系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)可見(jiàn)光譜（visible spectrum）的全覆蓋，用于多色激發(fā)和光遺傳學(xué)（optogenetic）操作，以及激發(fā)和發(fā)射光的全光纖傳輸。范說(shuō)，這是通過(guò)結(jié)合非波長(zhǎng)選擇性四分支纖維束專門完成的，該纖維束可以實(shí)現(xiàn)多色記錄（multicolor recording），同時(shí)還支持精確的光遺傳學(xué)刺激（圖 2）。該束與光電倍增管 (PMT) 相結(jié)合，以取代傳統(tǒng)的成像結(jié)構(gòu)。還使用了定制設(shè)計(jì)的鎖定放大器，以準(zhǔn)確分離 PMT 檢測(cè)到的具有不同波長(zhǎng)的兩個(gè)熒光信號(hào)，并有效抑制光遺傳學(xué)刺激引起的偽影（artifacts）和通道串?dāng)_(channel crosstalk)。

圖 2. 定制設(shè)計(jì)的四分支光纖束和多功能光纖光度測(cè)量系統(tǒng)。四分支纖維束（a）包括單纖維分支（i~iii）、集合分支（iv）和公共分支（v）。四分支光纖束 (b) 普通分支 (v) 示意圖。公共分支 v (500 μm) 總共由 85 根六邊形分布式光纖 (Φ50 μm/0.54 NA) 組成。束中心的三個(gè)較亮的光纖對(duì)應(yīng)于三個(gè)單光纖分支 (i~iii)，用于耦合到三個(gè)不同的激發(fā)光。四分支光纖束構(gòu)建的多功能光纖測(cè)光系統(tǒng)示意圖。將三個(gè)不同波長(zhǎng)的光源耦合到多模光纖中，并通過(guò)三個(gè)單纖分支 i~iii (c) 連接到鼠標(biāo)。多功能光纖測(cè)光系統(tǒng)的鎖定放大器示意圖（d）。這兩種激發(fā)光由具有不同頻率（450 nm，211 Hz；561 nm，531 Hz）的正弦信號(hào)調(diào)制。

“我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，表明該系統(tǒng)具有出色的透光性能。它能夠有效地激發(fā)和收集熒光信號(hào)，收集效率比傳統(tǒng)系統(tǒng)提高 20% 到 30%?！狈墩f(shuō)。

研究小組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的通道串?dāng)_，并成功記錄了伏隔核 (NAc) 中的神經(jīng)元 Ca2+ 和神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)信號(hào)——一種主要由中等多刺神經(jīng)元組成的結(jié)構(gòu)，其特點(diǎn)是多巴胺受體（dopamine receptors）的相對(duì)表達(dá)——同時(shí)在自由移動(dòng)的小鼠身上對(duì)同一部位的多巴胺能末端進(jìn)行精確的光遺傳學(xué)操作。研究人員還能夠在記錄時(shí)將刺激偽影（由于它們是非生理性的而導(dǎo)致噪聲干擾的短時(shí)間、高振幅的神經(jīng)尖峰）抑制到基礎(chǔ)噪聲水平（basal noise level）（圖 3）。

圖 3. 自由移動(dòng)小鼠 NAcLat（伏隔核外側(cè)殼）中神經(jīng)元活動(dòng)的同時(shí)雙色記錄和光遺傳學(xué)操作。 (a) 神經(jīng)元活動(dòng)手術(shù)同步雙色記錄和光遺傳學(xué)操作示意圖。 (b) 組織學(xué)證實(shí) NAcLat 中 GFP (綠色) 標(biāo)記的神經(jīng)元和 ChrimsonR (紅色) 標(biāo)記的多巴胺能神經(jīng)元末端表達(dá)。腦切片在前囟前 1.1 毫米處。 (c) 在該系統(tǒng)中同時(shí)進(jìn)行光遺傳學(xué)操作和實(shí)時(shí)雙色記錄時(shí)不存在刺激偽影。紅色條表示刺激時(shí)間。 (d) 在自由移動(dòng)的小鼠的 NAcLat 中同時(shí)記錄的 DA 和神經(jīng)元 Ca2+ 痕跡的示例。 (e) 響應(yīng)階段性光遺傳學(xué)刺激的平均 DA 信號(hào)和神經(jīng)元 Ca2+ 信號(hào)瞬變（10 次試驗(yàn)）。紅色條表示刺激時(shí)間。橙色段表示從基線統(tǒng)計(jì)顯著增加。 (f) 響應(yīng)強(qiáng)直光遺傳學(xué)的平均 DA 信號(hào)和神經(jīng)元 Ca2+ 信號(hào)瞬變。紅色條表示刺激時(shí)間。

“隨著它的進(jìn)步，纖維光度法在神經(jīng)科學(xué)家中越來(lái)越受歡迎，作為記錄基因定義的神經(jīng)元群體的便捷工具，”范說(shuō)。“而后續(xù)的改進(jìn)主要集中在不同的應(yīng)用需求上。”

早期用于光遺傳學(xué)操縱或記錄神經(jīng)元活動(dòng)的光纖測(cè)光技術(shù)和系統(tǒng)通常是分開的并獨(dú)立工作，它們只能在單個(gè)波長(zhǎng)下進(jìn)行操縱和單通道記錄。另一個(gè)挑戰(zhàn)是，由于光敏蛋白（spectrum of photosensitiveproteins）的激發(fā)光譜與基因編碼的鈣指示劑的發(fā)射光譜之間的重疊，在多色記錄和操作過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)刺激偽影（stimulation artifacts）。

“為了同時(shí)實(shí)現(xiàn)光遺傳學(xué)操作和雙色記錄，需要涉及更多具有光譜間距的波長(zhǎng)范圍熒光蛋白，”范說(shuō)?！耙虼?，光學(xué)系統(tǒng)需要完全覆蓋可見(jiàn)光譜。”

但范補(bǔ)充說(shuō)，這是目前可用的光纖光度測(cè)量系統(tǒng)的一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兪褂媒?jīng)典的落射熒光成像架構(gòu)（classical epifluorescenceimaging architecture）僅覆蓋 405 到 600 nm 左右的光譜，該架構(gòu)由一個(gè)物鏡和兩個(gè)或三個(gè)二向色鏡組成。 “在這種情況下，”她說(shuō)，“需要更多的分色鏡將多波長(zhǎng)光束耦合到一根光纖中，這使得系統(tǒng)擴(kuò)展光譜更加復(fù)雜?！?/p>

新的全光纖傳輸光度測(cè)量系統(tǒng)可用于“進(jìn)一步觀察不同類型神經(jīng)元的活動(dòng)，同時(shí)進(jìn)行光遺傳學(xué)操作和多色記錄，以監(jiān)測(cè)光遺傳學(xué)干預(yù)神經(jīng)回路引起的反饋效應(yīng)，”范說(shuō)。 “這現(xiàn)在被認(rèn)為是神經(jīng)回路和神經(jīng)系統(tǒng)疾病因果研究的‘夢(mèng)想方法’?！?/p>