癲癇組織中的免疫微環(huán)境為DRE和神經(jīng)炎癥疾病的介入治療提供指導(dǎo)

編者按

癲癇（復(fù)發(fā)性無(wú)因癲癇）十分常見(jiàn)，但目前對(duì)于其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。抗驚厥藥物是目前的一線治療方法，但是三分之一的患者患有藥物難治性癲癇(DRE)。目前只有切除性癲癇手術(shù)，即切除部分引起癲癇的腦組織，才能提供治愈方法。因此，深入研究癲癇的發(fā)病機(jī)制是十分重要的。研究者做出假設(shè)，不適當(dāng)?shù)拇傺讬C(jī)制可能是人類(lèi)患者的難治性癲癇（對(duì)抗癲癇藥物無(wú)反應(yīng)性）的發(fā)病機(jī)制。通過(guò)CITE-seq，揭示手術(shù)切除的癲癇病變組織的免疫轉(zhuǎn)錄組。本研究揭示了一種促炎微環(huán)境，包括小膠質(zhì)細(xì)胞的廣泛激活和其他促炎免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。通過(guò)配體-受體(LR)相互作用分析提供了小膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞之間的潛在浸潤(rùn)機(jī)制和直接的物理相互作用的證據(jù)，從而驗(yàn)證了上述發(fā)現(xiàn)?？傊@些數(shù)據(jù)提供了對(duì)癲癇組織中的免疫微環(huán)境的理解，并且可能為DRE和一些其他神經(jīng)炎癥疾病的介入治療提供指導(dǎo)。

1. 定義癲癇患者大腦中的駐留性和浸潤(rùn)性的免疫細(xì)胞

為了確定影響癲癇發(fā)生的免疫機(jī)制，研究者對(duì)手術(shù)切除的癲癇病灶組織進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表面蛋白測(cè)序（CITE-seq）。首先從6個(gè)體患者的11個(gè)腦組織樣本中分離免疫細(xì)胞，并使用10x Genomics單細(xì)胞平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，分析了85780個(gè)細(xì)胞和22968個(gè)基因數(shù)據(jù)。對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行聚類(lèi)和t-SNE分析，共鑒定26個(gè)聚類(lèi)。接下來(lái)進(jìn)一步利用表面蛋白標(biāo)記物鑒定集群，結(jié)果顯示：簇0-7、9-12和14（共13個(gè)簇）被鑒定為小膠質(zhì)細(xì)胞（CD45lo），簇8、15-17、19和21（共6個(gè)簇）被鑒定為浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞（CD45hi）。通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序分群，能夠同時(shí)識(shí)別大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞，并能夠定量譜系特異性表面蛋白和基因表達(dá)水平。

Fig.1 DRE患者腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞

2. 小膠質(zhì)細(xì)胞在DRE組織中表現(xiàn)出促炎表型

接下來(lái)，為了研究在DRE組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞中是否可以發(fā)現(xiàn)炎癥通路的激活，研究者分別通過(guò)單核細(xì)胞測(cè)序（snRNA-seq）和scRNA-seq，對(duì)來(lái)自非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對(duì)照組和ASD患者的腦組織、以及來(lái)自于在癲癇手術(shù)中被病理評(píng)估為正常的切除的人類(lèi)腦皮層組織mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在snRNA-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)中，來(lái)自非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對(duì)照組和ASD患者的小膠質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)了特征性的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。來(lái)自DRE患者的小膠質(zhì)細(xì)胞顯示了促炎細(xì)胞因子和趨化因子基因的表達(dá)。然而，在snRNA-seq數(shù)據(jù)集中，來(lái)自非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對(duì)照組或ASD的小膠質(zhì)細(xì)胞并沒(méi)有顯示出這些促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。通過(guò)比較DRE患者、非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對(duì)照組和ASD個(gè)體的小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)DRE小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)明顯升高。研究者通過(guò)免疫組化（IHC）成像分析對(duì)大腦微環(huán)境進(jìn)行成像，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述發(fā)現(xiàn)。

Fig.2 DRE患者、非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對(duì)照組和ASD患者腦組織中促炎基因和小膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因的表達(dá)

3. NVUs與免疫細(xì)胞之間的功能性配體-受體相互作用

為了研究來(lái)自DRE-M的NVUs與浸潤(rùn)性白細(xì)胞之間的相互作用，研究者創(chuàng)建了一個(gè)NVUs內(nèi)的細(xì)胞與浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞之間的配體-受體（LR）相互作用的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)節(jié)點(diǎn)之間共有809個(gè)LR相互作用，其中有265對(duì)獨(dú)特的LR對(duì)（有206對(duì)出現(xiàn)在NVU和CAM集群之間）。接下來(lái)，研究者進(jìn)一步探討了這種關(guān)系機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有三個(gè)CD4+節(jié)點(diǎn)均富集了IL7R的表達(dá)，編碼其同源受體的TSLP在NVUs中富集；TNF、CCL5和TGFB1在免疫細(xì)胞簇中表達(dá)，而它們的同源受體TNFRSF21、ACKR1和ACRL1在NVUs中表達(dá)，并使用CellChat R包進(jìn)一步驗(yàn)證了它們之間的互作結(jié)果?？傊琇R相互作用組網(wǎng)絡(luò)定義了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)偏向DRE-M的機(jī)制。

Fig.3 癲癇人腦免疫細(xì)胞及其與NVU細(xì)胞的相互作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)，研究者建立了TLE小鼠模型進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。RNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，TLE小鼠中有1600個(gè)基因顯著改變，有122個(gè)LR基因在人類(lèi)DRE中富集。在這些LR基因中，許多關(guān)鍵的LR對(duì)，包括趨化因子和細(xì)胞因子及其受體基因在TLE小鼠大腦中上調(diào)?？傊瑒?dòng)物癲癇模型進(jìn)一步的證實(shí)了人類(lèi)單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)。

Fig.4 LR基因在TLE癲癇小鼠模型中顯著調(diào)節(jié)

4. 小膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞之間的直接相互作用

Cluster 3表達(dá)CD3、CD11b和HLA-DR表面蛋白，說(shuō)明該群是T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的雙態(tài)簇。接下來(lái)研究者使用主要譜系蛋白表達(dá)標(biāo)記對(duì)Cluster 3進(jìn)行重新聚類(lèi)，進(jìn)一步分析了這些雙態(tài)簇的成分。結(jié)果共獲得6個(gè)cluster，包括CD8+ T細(xì)胞群（Cluster 0）、CD4+ T細(xì)胞群（Cluster 1）、B細(xì)胞群（Cluster 4）、NK細(xì)胞（Cluster 2）和巨噬細(xì)胞簇（Cluster 5）。研究者使用物理相互作用細(xì)胞測(cè)序（PICs）（PIC-seq），尋找由于物理相互作用而被調(diào)節(jié)的基因，隨后將差異表達(dá)的基因與來(lái)自?xún)煞N細(xì)胞類(lèi)型的小膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞的預(yù)期貢獻(xiàn)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，在物理相互作用后，促炎和細(xì)胞毒性功能相互增強(qiáng)。最后，研究者使用IHC和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了T細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞雙重免疫復(fù)合物，結(jié)合PIC-seq和IHC分析，發(fā)現(xiàn)與未直接接觸的小膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞相比，小膠質(zhì)細(xì)胞免疫細(xì)胞雙細(xì)胞明顯顯示出增加的促炎功能。

Fig.5 難治性癲癇患者腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞與浸潤(rùn)性T細(xì)胞的直接相互作用

主要結(jié)論

本研究通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表面蛋白測(cè)序（CITE-seq），揭示手術(shù)切除的癲癇病變組織的的促炎微環(huán)境，包括小膠質(zhì)細(xì)胞的廣泛激活和其他促炎免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)還提供了小膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞之間的潛在浸潤(rùn)機(jī)制和直接的物理相互作用的證據(jù)，從而驗(yàn)證了上述發(fā)現(xiàn)。總之，這些數(shù)據(jù)提供了對(duì)癲癇組織中的免疫微環(huán)境的理解，并且可能為DRE和一些其他神經(jīng)炎癥疾病的介入治療提供指導(dǎo)。