UL-1000超微量可見分光光度計測定RNA質(zhì)量檢測應用方案

簡介

核糖核酸(縮寫為RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種，即A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。

原理細胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取的實質(zhì)就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白，DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程。

儀器及試劑

美析UL-1000超微量可見分光光度計

離心管 離心機 電泳槽 凝膠板

細胞樣品
RNA提取試劑盒 熒光定量PCR Mix TRIZOL dNTP氯仿 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV異丙醇Taq酶DEPC水ddH2O TE MgCl2瓊脂糖 溴化乙錠MOPS甲醛 乙酸鈉EDTA EB溴酚蘭
樣品RNA的抽提
1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
3. RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA質(zhì)量檢測
1.紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將紫外分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。
（1）濃度測定
A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260x稀釋倍數(shù)x 40 ug/ml。具體計算如下：

RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測得A260= 0.21

RNA濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml或0.84 ug/ul

取5 ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：

35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

（2）純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測定
（1）制膠
1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37%甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4 M MOPS，pH 7.0

0.1 M 乙酸鈉

0.01 M EDTA
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

（2）準備RNA樣品
取3 ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

（3）電泳
上樣前凝膠須預電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下觀察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。

結(jié)果計算

RNA得率有很強的組織特異性，不同組織RNA的豐度和RNA提取的易難程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說，可通過分光光度計測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質(zhì)濃度和蛋白等有機物的吸收值。用標準樣品測得在波長260nm處，1ug/mlRNA鈉吸光度0.025（光程為1cm），即OD260=1時，樣品中RNA濃度為40ug/ml。通常分光光度計OD260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的。因此RNA提取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當濃度范圍，再用分光光度計檢測。按下面的共識計算總RNA濃度：

總RNA濃度（ug/ml）=OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml

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審核編輯 黃昊宇