半合成生物傳感器揭示輔酶A在細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡

輔酶A（Coenzyme A，CoA）是一種普遍存在的輔助因子，在大量的酶促反應(yīng)和各種細(xì)胞過程中都需要，包括檸檬酸循環(huán)、甾醇生物合成、氨基酸代謝、酮體生產(chǎn)和脂肪酸代謝。CoA濃度調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，或作為底物或變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。組蛋白和其他蛋白質(zhì)與酰基CoA的翻譯后修飾控制著大量蛋白質(zhì)的命運(yùn)。因此，CoA水平的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致各種病理。然而目前仍缺乏一種測(cè)量CoA在活細(xì)胞中的濃度的方法。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)薛林團(tuán)隊(duì)與德國(guó)馬克思普朗克醫(yī)學(xué)研究所Kai Johnsson團(tuán)隊(duì)在Nature Chemical Biology雜志在線發(fā)表題為“Probing coenzyme A homeostasis with semisynthetic biosensors”的研究論文，該研究開發(fā)了第一個(gè)用于測(cè)量哺乳動(dòng)物細(xì)胞不同細(xì)胞器CoA水平的生物傳感器。并提出了CoA生物合成的細(xì)胞圖，以提示細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體如何維持CoA池。

輔酶A（Coenzyme A，CoA）是新陳代謝的核心輔助因子之一。在真核生物中，CoA是由半胱氨酸、ATP和必需營(yíng)養(yǎng)素泛酸鹽合成的，泛酸鹽也被稱為維生素B5。泛酸在第一步被泛酸激酶（pantothenate kinase，PanK）磷酸化為4'-磷酸腺苷酸（4′-phosphopantothenat，PPan），隨后被磷酸腺苷酰半胱氨酸合成酶（phosphopantothenoylcysteine synthetase，PPCS）和磷酸腺苷酰半胱氨酸脫羧酶（phosphopantothenoylcysteine decarboxylase，PPCDC）轉(zhuǎn)化為4'-磷酸腺苷酸（4′-phosphopantetheine，PPanSH）。雙功能CoA合成酶（CoA synthase，COASY）通過濃縮PPanSH和AMP，將PPanSH轉(zhuǎn)化為去磷輔酶A （dephosphocoenzyme A，dPCoA），然后將dPCoA磷酸化形成CoA。此外，哺乳動(dòng)物和其他真核生物擁有一種單功能去磷輔酶A激酶（dephosphocoenzyme A kinase，DCAKD），它也催化輔酶A生物合成的最后磷酸化步驟。

CoA的濃度在亞細(xì)胞間室中不同，包括細(xì)胞質(zhì)、線粒體和過氧化物異構(gòu)體。據(jù)報(bào)道，線粒體CoA池是最大的，包含了肝、心臟和肌肉細(xì)胞中總CoA的80-95% 。然而，不同的亞細(xì)胞CoA池是如何被調(diào)節(jié)的還不清楚。要回答這個(gè)問題，定量亞細(xì)胞CoA水平的方法是必不可少的。目前測(cè)定輔酶A的方法是基于色譜法、質(zhì)譜法或酶法。它們需要溶解細(xì)胞或分離的線粒體，因此只能提供有限的亞細(xì)胞濃度信息。

在這項(xiàng)研究中，研究人員介紹了第一個(gè)測(cè)量活細(xì)胞中游離輔酶A濃度的半合成生物傳感器。該半合成生物傳感器是通過工程GFP-HaloTag融合蛋白與熒光配體的特異性標(biāo)記生成的。通過調(diào)整CoA和栓系配體的結(jié)合蛋白的相對(duì)親和力，可以合理地將傳感器的靈敏度提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上。它的讀數(shù)基于CoA依賴的F?rster GFP和熒光配體之間的共振能量轉(zhuǎn)移效率的變化。這種調(diào)優(yōu)對(duì)于CoA傳感器在不同細(xì)胞間隔中的使用非常重要，也確認(rèn)了生物傳感器的設(shè)計(jì)原則。CoA傳感器具有對(duì)CoA的高選擇性，對(duì)pH的變化相對(duì)不敏感。比率讀數(shù)允許比較CoA在不同條件下和不同亞細(xì)胞間室的相對(duì)濃度。

利用這種生物傳感器，研究人員探測(cè)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與CoA生物合成和運(yùn)輸?shù)谋姸嗟鞍踪|(zhì)的作用。并首次提供了不同細(xì)胞系中游離胞質(zhì)和線粒體[CoA]的絕對(duì)值。

CoA半合成生物傳感器揭示CoA的代謝平衡

綜上所述，這項(xiàng)研究描述了一種用于測(cè)量活細(xì)胞中游離胞質(zhì)和線粒體[CoA]的生物傳感器，并應(yīng)用該傳感器回答有關(guān)CoA穩(wěn)態(tài)的核心問題。未來期望CoA傳感器將成為研究CoA在代謝中的作用的重要工具。