淺析雙室微流控芯片用于再現(xiàn)?胰腺導(dǎo)管腺癌微環(huán)境

胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）占源胰腺癌癥的93%。PDAC被認(rèn)為是所有癌癥中最致命的，并且預(yù)后極差。PDAC患者總體上表現(xiàn)出高度的分子腫瘤異質(zhì)性，使治療復(fù)雜化，并阻礙了臨床試驗(yàn)的成功。

目前的體外技術(shù)不能充分復(fù)制PDAC腫瘤微環(huán)境（TMEs）中復(fù)雜的基質(zhì)成分，也不能模擬給定腫瘤的獨(dú)特遺傳表型。因此目前迫切需要開(kāi)發(fā)一種利用腫瘤相關(guān)信息預(yù)測(cè)藥物反應(yīng)的個(gè)性化治療方法。

鑒于此，美國(guó)芝加哥拉什大學(xué)Faraz Bishehsari教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種腫瘤芯片裝置，通過(guò)結(jié)合患者衍生類(lèi)器官（PDOs）和基質(zhì)細(xì)胞，特別是胰腺星狀細(xì)胞（PSCs）和巨噬細(xì)胞（U937），成功建立了一個(gè)復(fù)雜的包含纖維增生間質(zhì)和免疫細(xì)胞的腫瘤環(huán)境，延長(zhǎng)了PDOs細(xì)胞功能和壽命，且證明了靶向基質(zhì)導(dǎo)致對(duì)癌細(xì)胞的化療效果顯著增加，從而驗(yàn)證了該腫瘤芯片裝置用于藥物測(cè)試的可行性。

首先，研究人員通過(guò)細(xì)針活檢（FNB）收集PDAC患者的活檢樣本，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)使其在3D基質(zhì)膠環(huán)境中形成球形類(lèi)器官。

H&E和上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了類(lèi)器官細(xì)胞與原始組織在結(jié)構(gòu)和功能上的一致性。將基質(zhì)細(xì)胞（PSCs和U937）和類(lèi)器官共培養(yǎng)，U937和類(lèi)器官發(fā)生雙向誘導(dǎo)增殖，且類(lèi)器官平均直徑均明顯大于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，免疫熒光成像顯示PSCs分泌了更多的膠原蛋白。

并且在MIA PaCa-2細(xì)胞（一種胰腺細(xì)胞系）中也觀(guān)察到癌細(xì)胞和U937細(xì)胞在共培養(yǎng)時(shí)的雙向增殖效應(yīng)。

圖1 患者來(lái)源的類(lèi)器官（PDOs）的增殖特性，以及與基質(zhì)細(xì)胞的雙向促進(jìn)作用

腫瘤細(xì)胞的侵襲性實(shí)驗(yàn)顯示PCCs在與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)遷移的距離更大，同時(shí)H&E和EpCAM染色證實(shí)了遷移的細(xì)胞是PCCs。該實(shí)驗(yàn)表明共培養(yǎng)時(shí)基質(zhì)細(xì)胞能誘導(dǎo)PCCs的侵襲性。

圖2 基質(zhì)細(xì)胞增加了癌變上皮細(xì)胞（PDOs）的侵襲性

該微流控芯片由兩個(gè)被多孔膜隔開(kāi)的腔室組成，從上部腔室的入口裝載細(xì)胞，下層的腔室入口通過(guò)導(dǎo)管與含有培養(yǎng)基（有機(jī)類(lèi)培養(yǎng)基∶RPMI=1∶1）的注射器相連，注射器與泵相連以5ul/h的流速持續(xù)灌注介質(zhì)。為了觀(guān)察PCCs的生長(zhǎng)情況，將2000個(gè)類(lèi)器官懸浮于50%基質(zhì)膠中，載入每個(gè)芯片的上腔室，培養(yǎng)1周后，類(lèi)器官?gòu)那蛐无D(zhuǎn)化為二維（2D）結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞被稱(chēng)為PCCs。

PCCs在16天內(nèi)占據(jù)了該室的整個(gè)內(nèi)部空間。最初，類(lèi)有機(jī)物由基質(zhì)凝膠支撐，以保持芯片中的3D球形結(jié)構(gòu)，但最終轉(zhuǎn)變成2D層，這可能是基質(zhì)膠降解的結(jié)果。

接下來(lái)研究人員進(jìn)行了活-死生存實(shí)驗(yàn)證明了芯片表明2D細(xì)胞的存活，同時(shí)癌變上皮細(xì)胞膜中EpCAM和pERK的表達(dá)水平也表明了細(xì)胞存活和生長(zhǎng)。隨后的共培養(yǎng)和藥物治療研究實(shí)驗(yàn)均在3D類(lèi)器官仍存在的9天內(nèi)進(jìn)行。

圖3 一種用于PDOs的培養(yǎng)和生長(zhǎng)的雙室微流控芯片

為了概括PDAC TME的特征，研究人員將基質(zhì)細(xì)胞與PCCs結(jié)合，并將它們加載到芯片的上腔。在共培養(yǎng)6天里，PCCs生長(zhǎng)并發(fā)生結(jié)締組織塑性反應(yīng)。到第6天，基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)芯片中的PCC生長(zhǎng)明顯快于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，占據(jù)了腔室空間的83.6%，證實(shí)了基質(zhì)對(duì)芯片中PCC增殖的影響。

與芯片相比，細(xì)胞的平行多孔板共培養(yǎng)顯示出顯著較低的癌細(xì)胞生長(zhǎng)，這進(jìn)一步支持了使用芯片作為一個(gè)優(yōu)越的平臺(tái)來(lái)再現(xiàn)癌細(xì)胞的旺盛生長(zhǎng)。

圖4 原發(fā)癌細(xì)胞（PCC）與基質(zhì)細(xì)胞在芯片上的生長(zhǎng)

明場(chǎng)成像和H&E染色顯示了PCCs與芯片中基質(zhì)細(xì)胞的密切相互作用。U937細(xì)胞和PSCs中CD68和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的染色分別揭示了PCCs周?chē)|(zhì)細(xì)胞的存在。

同時(shí)幾種標(biāo)記物在基因表達(dá)水平上進(jìn)一步表征了共培養(yǎng)的PSCs和U937細(xì)胞。

圖5 在芯片中PDAC TME的再現(xiàn)

為了表征芯片的藥物反應(yīng)測(cè)試功能，研究人員首先分別在PSCs、U937細(xì)胞和類(lèi)器官中測(cè)定了ATRA、Clodrosome和吉西他濱的IC50值。且實(shí)驗(yàn)表明基質(zhì)消耗劑的IC50值不影響PCCs或MIA PaCa-2細(xì)胞的存活力。

用來(lái)自一名患者的類(lèi)器官考查PCCs的體外藥物反應(yīng)，將細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞一起接種到芯片中，培養(yǎng)6天后，將吉西他濱或吉西他濱與ATRA和Clodrosome以其IC50值灌注芯片72h，然后在第9天PFA固定和染色，與未經(jīng)治療相比，吉西他濱誘導(dǎo)的PCC Caspase-3表達(dá)可評(píng)估顯著的PCC凋亡。結(jié)果顯示，在腫瘤芯片模型中，TME調(diào)節(jié)劑對(duì)化療的抗腫瘤療效有增強(qiáng)作用。

圖6 基質(zhì)消耗在化療反應(yīng)中的影響

在這項(xiàng)研究中，研究人員開(kāi)發(fā)了一種最先進(jìn)的多細(xì)胞組織芯片模型，該模型顯示了原代PDOs長(zhǎng)期細(xì)胞存活率的提高，證實(shí)了基質(zhì)細(xì)胞在PDAC惡化中的顯著影響，以及癌性上皮細(xì)胞通過(guò)膠原沉積和癌癥相關(guān)基因表達(dá)劫持基質(zhì)細(xì)胞功能以創(chuàng)造有利TME的能力。

PDOs和基質(zhì)細(xì)胞在微流控芯片裝置中的共培養(yǎng)可再現(xiàn)特定患者的TME，因此可用于在臨床應(yīng)用前在實(shí)驗(yàn)室中評(píng)估任何抗癌藥物的敏感性。最后，可通過(guò)提供所需的技術(shù)數(shù)據(jù)來(lái)設(shè)計(jì)可以?xún)?yōu)化藥物反應(yīng)的生物測(cè)定工具，從而推進(jìn)PDAC個(gè)性化/精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41378-022-00370-6

審核編輯：劉清