點(diǎn)成分享 | 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定之考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法

蛋白質(zhì)是組成生物細(xì)胞、組織的重要成分，生物的所有生命活動(dòng)都離不開(kāi)蛋白質(zhì)的參與。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。生物材料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定是生物學(xué)研究中最重要也是最基本的實(shí)驗(yàn)操作之一，目前常見(jiàn)的測(cè)定方法有考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)、紫外吸收法、雙縮脲法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lorry法）、二喹啉甲酸法（BCA法）和凱式定氮法（Kjedahl法）等。每種方法原理不同，操作不同，都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。

本文介紹的是考馬斯亮藍(lán)法，即Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的相關(guān)內(nèi)容，它是通過(guò)染色方法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)濃度的方法，是目前迅速可靠且靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定方法之一。

實(shí)驗(yàn)原理：

Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。考馬斯亮藍(lán)染料（G-250）在酸性溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基結(jié)合，使得染料的最大光吸收峰位置由原來(lái)的465nm變?yōu)?95nm，溶液顏色也由原來(lái)的棕紅色變?yōu)樗{(lán)色，反應(yīng)迅速且穩(wěn)定，形成的化合物顏色深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系，因此可通過(guò)測(cè)定結(jié)合染色后溶液在595nm處的光吸收度值來(lái)計(jì)算溶液中蛋白質(zhì)的含量。

通過(guò)分光光度計(jì)先測(cè)定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液染色后在波長(zhǎng)595nm的吸光度A595并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后測(cè)定同樣染色后的待測(cè)蛋白溶液在波長(zhǎng)595nm的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可計(jì)算出待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。

實(shí)驗(yàn)器材：

分光光度計(jì)（例如點(diǎn)成DEN-600小型光度計(jì)）

渦旋混勻器

試管及試管架

塑料/玻璃比色皿

微量移液器

主要溶液/試劑：

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：可用牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。配制成1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，4℃存放。

考馬斯亮藍(lán)G250染料試劑：稱(chēng)取100 mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于50mL的95%乙醇后加入120mL 85%的磷酸，最后加入去離子水將試劑稀釋到1L。

待測(cè)蛋白溶液

實(shí)驗(yàn)操作：

制取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：可取普通潔凈的試管7支，1號(hào)管取放0.1mL去離子水作為空白組，2-6號(hào)用微量移液器分別加入1.0mg/mL的BSA溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL，然后每管均用去離子水補(bǔ)充到0.1mL，另外7號(hào)試管取放待測(cè)蛋白溶液0.1mL，所有試管用渦旋混勻器充分混勻；

加入染色試劑：用移液器或者移液管向上述試管分別加入3.0mL考馬斯亮藍(lán)G250試劑，用渦旋混勻器輕輕快速混合均勻；

比色：考馬斯亮藍(lán)試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合速度快，2-5分鐘即可完成，1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，故可以在溶液靜置5分鐘后在分光光度計(jì)上測(cè)定各試管溶液在波長(zhǎng)595nm處的光吸收值A(chǔ)595；

比色時(shí)使用的比色皿最好選用玻璃或者塑料比色皿，不要使用石英或者硅膠比色皿，因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)染料容易結(jié)合附著于石英或硅膠材料上，不易洗去染色。

比色完成后及時(shí)用水清洗，再用40%乙醇潤(rùn)洗，洗去顏色，最后再用水洗凈。

如果使用的是塑料比色皿，乙醇潤(rùn)洗時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，決不能在乙醇或者丙酮中長(zhǎng)時(shí)間浸泡，因?yàn)槟菚?huì)導(dǎo)致塑料比色皿溶脹失真。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)595為縱坐標(biāo)作圖，可進(jìn)行直線(xiàn)擬合，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

計(jì)算待測(cè)蛋白質(zhì)濃度：將分光光度計(jì)測(cè)出的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的光吸收度A595值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可算出待測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

點(diǎn)成DEN-600光度計(jì)， 是一款緊湊、便攜、可電池供電的光度計(jì)，可以方便地放置在生物安全柜、培養(yǎng)箱中，該設(shè)備可容納10mm光程的標(biāo)準(zhǔn)比色皿、普通圓底試管或離心管等。USB連接和DEN軟件可進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算。600 nm波長(zhǎng)光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)可以進(jìn)行如下測(cè)量：估算細(xì)胞總數(shù)（OD600）、濁度測(cè)量（McFarland單位）、蛋白質(zhì)濃度測(cè)量（Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定法）。分光光度計(jì)通常應(yīng)用于這些領(lǐng)域，因此DEN-600可作為分光光度計(jì)的平價(jià)替代品。

審核編輯 黃昊宇