基于CRISPR技術(shù)的高特異和高靈敏分子診斷方法CRISPR-Dx

一直以來，病原體快速和多重檢測都是全球衛(wèi)生安全領(lǐng)域關(guān)注的重點方向。在現(xiàn)有檢測方法中，二代測序（NGS）可提供病原體詳細信息，但檢測時間久且成本高；PCR技術(shù)可以實現(xiàn)病原體多重檢測，但熒光探針發(fā)射光譜經(jīng)常重疊，且易混淆識別目標，使單次可檢病原體數(shù)量受限；而當前被廣泛使用的、基于CRISPR技術(shù)所研發(fā)的高特異和高靈敏分子診斷方法（CRISPR-Dx）也存在多重檢測受限和高成本等問題。

基于以上挑戰(zhàn)，中國科學院精密測量院楊運煌團隊展開研究，于近期在Nature Communications上發(fā)表了題為“Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification”的文章，提出一種名為“MiCaR”的高性能多靶標檢測平臺。

“MiCaR”平臺檢測原理

“MiCaR”多靶標核酸檢測技術(shù)基于微流控空間編碼和CRISPR-Dx技術(shù)，可在40分鐘內(nèi)檢測30種不同的病原體，靈敏度達到了0.26 aM。“MiCaR”檢測平臺特點可總結(jié)為：（1）有效且正確擴增多個（如 ≥ 4個）核酸靶點；（2）在合適的溫度下擴增和識別靶標；（3）精確識別靶標，不受任何干擾；（4）準確區(qū)分信號并將其與對應(yīng)靶標進行關(guān)聯(lián)。研究人員通過有效地檢測9價HPV疫苗對應(yīng)的9種HPV亞型，證明了“MiCaR”的實用性以及其在感染性疾病診斷和流行病學監(jiān)測方面的潛力和應(yīng)用價值。

“MiCaR”平臺HPV檢測流程

研究人員以HPV亞型檢測為例，演示了“MiCaR”平臺的使用流程。首先進行取樣，加熱樣本釋放核酸，將釋放的核酸直接進行重組酶聚合酶擴增（RPA），最后將擴增產(chǎn)物和CRISPR檢測液加入到放射狀芯片（SS-Chip）中，加熱后讀取結(jié)果。其中SS-Chip由30個孔位輪狀輻射分布并與中央孔位相連，CRISPR檢測液提前加入30個孔位，樣本從中央孔位加載，每個孔位都能獨立進行CRISPR檢測。

“MiCaR”平臺對九種HPV亞型檢測

為驗證“MiCaR”平臺對九價疫苗里9種HPV病毒亞型檢測能力，該研究將含有9種HPV亞型各自特定片段的質(zhì)粒和9種crRNA進行交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示其檢測特異性高（如下圖所示）；制備9種不同濃度的HPV亞型靶標質(zhì)粒（10?12 M、10?13 M、10?1? M、10?1? M、10?1? M、10?1? M、10?1? M、0 M）驗證其靈敏度，結(jié)果顯示對所有靶標檢測限達10?1? M至10?1? M。

9種HPV質(zhì)粒和9種crRNA交叉實驗

進一步對100例HPV臨床樣本分型檢測，結(jié)果顯示“MiCaR”檢測性能良好，陽性和陰性預(yù)測一致性分別為97.8%和98.1%，靈敏度和特異性分別為97.8%和98.1%。

HPV臨床檢測（紅色）和“MiCaR”檢測（綠色）結(jié)果比對

對八種呼吸道病毒檢測板（RVP）進行檢測

研究基于“MiCaR”的方法檢測8種最具臨床相關(guān)性的呼吸道病毒，包括B型流感病毒（FLUBV）、人冠狀病毒NL63（HCoV-NL63）、人冠狀病毒OC43（HCoV-OC43）、人呼吸道合胞病毒（HRSV）、人冠狀病毒HKU1（HCoV-HKU1）、SARS-CoV-2、人副流感病毒3型（HPIV-3）和人偏肺病毒（HMPV），通過對8種RVP靶標質(zhì)粒與8種crRNA進行交叉反應(yīng)實驗，和對8種RVP靶標混合質(zhì)粒與8種crRNA分別進行CRISPR檢測，結(jié)果均表明“MiCaR”對RVP靶標檢測強特異性，進一步證明“MiCaR”方法可以作為一種多病原體核酸檢測的通用平臺。

8種RVP靶標檢測特異性結(jié)果

該研究團隊表示，“MiCaR”充分展現(xiàn)了多重RPA的擴增、CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在靶標識別方面的高特異性，以及微流控裝置在液體處理方面的顯著作用。該研究雖然只通過9種HPV亞型和8種呼吸道病毒驗證“MiCaR”檢測平臺的通用性，但其單次檢測靶標數(shù)量可達30個。團隊將繼續(xù)優(yōu)化“MiCaR”擴增和檢測條件及微流控裝置，以實現(xiàn)一管法和自動化操作。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41467-022-34086-y

審核編輯：劉清