用于肌紅蛋白檢測的時間分辨熒光側(cè)流層析技術(shù)

急性心肌梗死（AMI）是由冠狀動脈粥樣硬化引起的健康問題，有著較高發(fā)病率和死亡率。心電圖（ECG）是目前用于測量和診斷心臟節(jié)律異常的主要方法，在心臟病的診斷中具有重要地位。但局限于許多AMI早期患者沒有明顯的ECG改變，ECG往往無法診斷早期AMI。

為了克服這些缺點(diǎn)，對AMI的生物標(biāo)志物進(jìn)行有效檢測成為了很好的策略。肌紅蛋白是一種重要的細(xì)胞質(zhì)血紅素蛋白，存在于所有肌肉中。當(dāng)心肌壞死時，血清肌紅蛋白水平在1～3 h內(nèi)升高，通常在6～9 h時內(nèi)達(dá)到峰值，在24 h內(nèi)恢復(fù)正常。因此，當(dāng)肌紅蛋白含量升高時，可以提示早期心肌梗死癥狀，是一種具有較高特異性和敏感性的AMI的生物標(biāo)志物。因此，在生命科學(xué)領(lǐng)域，肌紅蛋白的檢測方法有著較為廣泛的研究。

時間分辨熒光側(cè)流層析技術(shù)是一種靈敏度高、檢測時間短、可用于現(xiàn)場篩查的定量檢測技術(shù)，盡管其具有諸多優(yōu)勢，但也存在一些不足：對免疫層析技術(shù)來講，測試條之間的重復(fù)性問題是最大的挑戰(zhàn)，而重復(fù)性差大部分原因在于該技術(shù)采用層析膜以及其他薄膜進(jìn)行檢測，需要保證液體流動一致性。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，針對上述不足，湖南大學(xué)唐昊課題組研究設(shè)計(jì)了一種時間分辨熒光結(jié)合微流控芯片技術(shù)，并將其作為肌紅蛋白的便捷檢測方法，以期解決重復(fù)性差的問題，并提高分析過程的自動化程度。相關(guān)研究成果以論文形式于近期發(fā)表于《中國科技論文在線精品論文》期刊。

該檢測方法原理如圖1所示。首先，將氨基化玻片作為肌紅蛋白抗體的固相載體，利用馬來酰亞胺與巰基的邁克爾加成法實(shí)現(xiàn)肌紅蛋白抗體的固定。同理可將肌紅蛋白抗體Myo-Ab3固定于時間分辨熒光微球（TRFM）上。隨后，將抗體化玻片預(yù)先埋入微流控芯片中，并通過抗原-抗體的特異性結(jié)合向已標(biāo)記肌紅蛋白抗體Myo-Ab3的時間分辨熒光微球中加入100 μL肌紅蛋白抗原Myo-Ag1，得到時間分辨熒光微球-肌紅蛋白抗體的復(fù)合結(jié)構(gòu)。

接著，將反應(yīng)混合液從進(jìn)樣口加入到進(jìn)樣室后垂直放置微流控芯片，通過重力作用使混合液流至玻片處與其反應(yīng)，得到時間分辨熒光微球-抗體1-抗原-抗體2-玻片的雙抗體夾心復(fù)合物，此反應(yīng)過程持續(xù)2 min，反應(yīng)溫度為37℃。該復(fù)合物經(jīng)過持續(xù)2 min的洗滌過程后可直接在玻片上進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)操作簡單。

圖1 時間分辨熒光結(jié)合微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于肌紅蛋白的便捷檢測原理示意圖

引入微流控芯片后，研究人員利用免疫色譜讀取儀測量熒光強(qiáng)度考察了該體系的可行性。結(jié)果如圖2a所示，沒有肌紅蛋白抗原存在時，玻片的熒光值較低，說明由于缺少抗原抗體的特異性結(jié)合，玻片上無法形成抗原-抗體的復(fù)合結(jié)構(gòu)；而當(dāng)加入含有263 ng/mL的肌紅蛋白抗原的溶液時，玻片的熒光值明顯升高，說明玻片上的肌紅蛋白抗體Myo-Ab2與標(biāo)記抗體時間分辨熒光微球-抗原的復(fù)合結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，因此時間分辨熒光微球被成功固定于玻片上，熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。此結(jié)果表明該檢測體系是可行的。另外，還得到了在263 ng/mL，26.3 ng/mL以及2.63 ng/mL 3種不同濃度抗原下熒光的信噪比，結(jié)果如圖2b所示，隨著肌紅蛋白抗原濃度的增加，信躁比逐漸增大，表明了該免疫檢測體系對于不同濃度抗原的成功響應(yīng)。



圖2 微流控芯片方法的可行性考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖：（a）有無肌紅蛋白抗原存在時的熒光強(qiáng)度對比；（b）免疫檢測體系對于不同濃度肌紅蛋白抗原的響應(yīng)情況

隨后，為考察引入微流控芯片的免疫體系的檢測靈敏度，在最佳反應(yīng)條件下對一系列不同濃度的肌紅蛋白進(jìn)行檢測。如圖3b所示，當(dāng)肌紅蛋白抗原的濃度在0～100 ng/mL范圍內(nèi)時，熒光強(qiáng)度和肌紅蛋白抗原的濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9879，評估檢測下限為3.85 ng/mL，檢測靈敏度較高，該檢測方法和很多其他檢測方法相比，靈敏度相當(dāng)。

圖3 引入微流控芯片的免疫體系中不同濃度肌紅蛋白抗原對應(yīng)的熒光檢測結(jié)果：（a）熒光信躁比結(jié)果；（b）線性擬合工作曲線

綜上所述，為解決時間分辨熒光免疫層析定量檢測技術(shù)重復(fù)性差的缺陷，該研究設(shè)計(jì)并開發(fā)了一種新型免疫法，將時間分辨熒光技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，對肌紅蛋白進(jìn)行高效率檢測，僅十分鐘內(nèi)便可完成檢測全過程。該檢測方法將試劑反應(yīng)、樣品分離、產(chǎn)物檢測等過程集中于一塊微小尺寸的芯片上，提高了分析過程的自動化程度。

此外由免疫色譜讀取儀檢測出的熒光信號強(qiáng)度與抗原濃度成正比，因此該方法可以作為定量分析的依據(jù)，并且得出此新型免疫方法檢測肌紅蛋白的最低檢測限為3.85 ng/mL，靈敏度較高。該方法具有實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、操作簡單、成本低廉、檢測限低、自動化程度高等特點(diǎn)，適用于肌紅蛋白的臨床檢驗(yàn)。

審核編輯：劉清