透明樣本的成像工具-相差（相襯）顯微鏡

人眼可以看見物體，是因為眼睛中晶狀體收集了物體發(fā)出的光線并將這些光線匯聚在視網(wǎng)膜上進行了成像，如太陽、電燈和螢火蟲等。對于不發(fā)光且不透明的物體，通過其表面反射光線成像，物體對不同波長的吸收不同會呈現(xiàn)出不同的顏色。對不發(fā)光的透明物體來說，因為與周圍介質(zhì)的折射率存在差異，在兩者界面上會產(chǎn)生反射與折射，通過反射光或透射光與背景的差異就看到了物體。在常見的物質(zhì)中，空氣的折射率約為1、水的折射率約為1.33、普通玻璃的折射率為1.5，將玻璃片置于空氣中時較容易被看到，而將其放入水中時就較難被看到了，這是由于玻璃片與水的折射率比較接近，光在兩者界面產(chǎn)生的反射和折射現(xiàn)象不是很明顯，因此不易被觀察到。若玻璃片與周圍介質(zhì)的折射率更接近就沒辦法被看到了。

圖1 玻璃片在空氣和水中的情況 折射率相近導(dǎo)致物體不易被觀察到的情況在顯微成像中也是經(jīng)常遇到的問題。顯微鏡的發(fā)明與使用對生命科學(xué)的發(fā)展具有劃時代的意義，若沒有它，人類對生物的認(rèn)識只能停留在人眼可見的水平，不能深入到微觀世界，也不能對一些生命現(xiàn)象進行科學(xué)解釋，更不能對生命現(xiàn)象進行合理利用和干預(yù)。在生命科學(xué)的研究領(lǐng)域中，想要深入了解細(xì)胞、組織或器官內(nèi)的生命活動過程就需要先對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組織進行深入了解，這些樣本多數(shù)為無色透明，在明場照明顯微鏡下很難清晰地觀測其微細(xì)結(jié)構(gòu)。為了可以看到這些樣本的更多細(xì)節(jié)，科學(xué)家們也是煞費苦心。

染色和染料常在生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域被用于提高生物組織的可見度，同樣，熒光探針標(biāo)記也具有類似的用途，但是兩種方式在進行顯微觀察時都需要對樣本進行預(yù)處理，這個過程繁雜且會破壞樣本的生理狀態(tài)。隨著需求的日益增加，一種簡潔且可研究細(xì)胞正常生命周期的相差顯微系統(tǒng)就誕生了！

相差顯微鏡最早是由荷蘭物理學(xué)家Frits Zernike提出的，它是一種可增強樣本與背景對比度的顯微成像系統(tǒng)（如圖2所示），在不對透明樣本進行染色處理的情況下可獲得如活細(xì)胞、微生物、薄組織切片等透明樣本的高對比度圖像。

圖2 相差顯微鏡

在介紹相差顯微鏡的工作原理前先來了解明場顯微鏡是如何工作的：當(dāng)照明光通過生物標(biāo)本時，由于細(xì)胞各部位細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，樣本對光的吸收程度不同，在顯微鏡視場中就可見到明暗度不同的各物點圖像，這是由光的振幅不同所致，即相機采集到的是光強信息。但是如果樣本中需要觀察的物點近乎透明，視場中就看不出明顯的灰度差別。但是光波在通過各種物點時會發(fā)生衍射和折射，使得通過的光波因延遲而發(fā)生了偏離，其光程就有了一定的差別，即產(chǎn)生了所謂“相位差”。人眼不能分辨這種相位差，但可以設(shè)法將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差。相差顯微鏡就是利用光的干涉原理，是將相位的微小變化轉(zhuǎn)換成相應(yīng)振幅變化的顯微觀察裝置。

接下來介紹一下相差顯微鏡是如何將這種相位變化轉(zhuǎn)換為振幅變化的。圖3為常見的使用臨界照明方式的明場顯微成像光路，平行光束經(jīng)過聚光鏡后會聚于樣本平面進行照明，樣本各區(qū)域?qū)獾奈粘潭炔煌?，所以在顯微鏡視場中可見到明暗度不同的各物點圖像。

圖3 明場顯微成像光路

圖6為相差顯微系統(tǒng)的基礎(chǔ)光路圖，與圖3進行對比可以發(fā)現(xiàn)，相差顯微系統(tǒng)的光路就是在臨界照明的明場照明顯微系統(tǒng)的基礎(chǔ)上增加了一個環(huán)形的光闌和一個環(huán)形的相位板，這兩個器件也就是相差顯微系統(tǒng)的核心器件。環(huán)形光闌的作用是產(chǎn)生中空的環(huán)形光，不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的，透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦面與相板上的共軛面重合；相位板安裝在物鏡的后焦面處，相位板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜，它除了能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。

圖4 環(huán)形光闌和相位板

如圖5和圖6所示，當(dāng)入射照明光通過樣本后，部分光會發(fā)生衍射偏離原來路徑（如圖5左側(cè)光線所示，圖6中綠色區(qū)域表示被物鏡收集的衍射光），但是大部分的入射光不發(fā)生衍射而是沿著原來路徑傳播（圖5中物鏡后的橙色區(qū)域），未發(fā)生衍射的光經(jīng)過相位環(huán)的衰減后在相機上形成平面背景。而偏離原來路徑的衍射光在經(jīng)過相位環(huán)后會發(fā)生一個90°的相移，經(jīng)過相移的衍射光和未衍射光最終在相機上形成干涉圖樣，并將物體的相位信息轉(zhuǎn)化為光強信息記錄下來。

圖5 照明光照射樣本后的衍射情況

圖6 相差顯微光路

根據(jù)基礎(chǔ)的相差顯微系統(tǒng)光路以及多軸籠式結(jié)構(gòu)的特點，對基礎(chǔ)的相差顯微光路進行修改（如圖7），然后使用多軸籠式結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)器件根據(jù)光路完成實驗系統(tǒng)的搭建（如圖8）。

圖7 系統(tǒng)光路

圖8 系統(tǒng)實物

選擇口腔上皮細(xì)胞、蛙卵單細(xì)胞和蘚精子器切片這些樣本作為實驗樣本，使用相同的放大倍率分別采集同一區(qū)域的明場圖像和相差圖像（如圖10所示）。

圖9 測試樣品

圖10 樣本的明場圖像（左）與相差圖像（右） a、b：口腔上皮細(xì)胞；c、d：蛙卵單細(xì)胞；e、f：蘚，精子器切片。

通過明場圖像與相差圖像的對比可發(fā)現(xiàn)，在相差顯微觀察中可以看到一些在明場顯微觀察中無法看清的細(xì)節(jié)，

注意：必須調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相位板的環(huán)狀圈重合，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該延遲相位的光波不能延遲，就失去了相差顯微鏡的作用。另外，相差顯微鏡的局限在于不適合厚度大的樣品，一般以5-10μm為宜。

圖11 光闌與相位板不同位置對圖像的影響

審核編輯 ：李倩