耦合PCR技術(shù)實現(xiàn)各種致病菌和病毒核酸的檢測

傳染性細(xì)菌和病毒，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）、中東呼吸綜合征（MERS）冠狀病毒（MERS- CoV）、埃博拉病毒、SARS- CoV -2、登革熱病毒、肺結(jié)核等，給人類健康帶來了災(zāi)難性的后果和威脅。到目前為止，診斷這些病原體的金標(biāo)準(zhǔn)方法依賴于這些病原體每個獨(dú)特基因的PCR擴(kuò)增子熒光讀出。同時，分子診斷結(jié)果的納米孔讀出正在迅速發(fā)展，并探索了許多可能性。由于納米孔計數(shù)器具有計數(shù)短DNA雙鏈的能力，而PCR可以產(chǎn)生大量設(shè)計長度的DNA雙鏈，因此將這兩種技術(shù)結(jié)合在一起比較直觀。

近日，廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院王家海教授團(tuán)隊聯(lián)合廣州市疾病預(yù)防控制中心何榮研究員、中國地質(zhì)大學(xué)夏帆教授團(tuán)隊在納米孔傳感領(lǐng)域取得重要進(jìn)展，開發(fā)了納米孔計數(shù)器耦合PCR技術(shù)檢測多種病毒核酸的方法，成果以“Bare glassy nanopore for length-resolution reading of PCR amplicons from various pathogenic bacteria and viruses”為題發(fā)表在國際知名學(xué)術(shù)期刊Talanta上。王家海教授、何榮研究員和夏帆教授為共同通訊作者，李慧珍副教授為第一作者，廣州大學(xué)為第一通訊單位。

圖1 玻璃狀納米孔檢測細(xì)菌或病毒基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物方法示意圖

該研究采用玻璃狀納米孔，在不添加任何有機(jī)添加劑或填充水凝膠的情況下，全面研究了199 ~ 2996堿基對范圍內(nèi)DNA雙鏈的長度依賴性分辨率。研究發(fā)現(xiàn)，玻璃狀納米孔具有極好的區(qū)分至少200個堿基對分離的DNA雙鏈的能力。長度大于2000堿基對的DNA雙鏈堵塞電流峰值分布較寬，不適合進(jìn)行多路復(fù)用研究。因此，多路復(fù)用研究的最佳選擇是基于200 ~ 2000個堿基對的雙鏈長度范圍。長度在200到2000堿基對之間的DNA雙鏈的納米孔易位具有最好的電流特征，在定量和定性結(jié)果方面具有顯著的性能。

此外，研究結(jié)果表明，5個不同長度、間隔超過200個堿基對的PCR擴(kuò)增子，分別對應(yīng)于Lambda DNA基因組的不同片段，可以同時被解析。設(shè)計長度的每個DNA雙鏈的電流特征表明，較長的DNA雙鏈具有較大的阻塞電流峰值幅值中值。此外，基于玻璃狀納米孔的長度分辨能力，可以在高分辨率下識別臨床樣本中包括SARS-CoV-2在內(nèi)的各種致病菌和病毒。該產(chǎn)品的電子讀出可以省去探針設(shè)計和熒光標(biāo)簽，在沒有任何其他信號轉(zhuǎn)換器（CRISPR-Cas12）的情況下，其檢出限可降至7.5 aM，如實反映了PCR擴(kuò)增的效率。

圖2玻璃狀納米孔對病毒或細(xì)菌四種不同基因PCR產(chǎn)物的鑒別能力



圖3玻璃狀納米孔SARS-CoV-2 Delta突變體中5個不同基因PCR產(chǎn)物的鑒別能力






審核編輯：劉清