用于細(xì)菌檢測的紙基傳感器

病原菌的檢測對于預(yù)防和治療感染以及保障食品安全至關(guān)重要。目前的金標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)，例如培養(yǎng)基檢測和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），不僅耗時(shí)，并且還需要集中在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。因此，人們致力于開發(fā)快速、廉價(jià)、便攜且不需要專門培訓(xùn)的即時(shí)檢測（POC）裝置?；诩垙埖姆治鲅b置恰好滿足上述標(biāo)準(zhǔn)，特別適合在資源匱乏的環(huán)境中部署。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近日，新南威爾士大學(xué)（The University of New South Wales，UNS）化學(xué)工程學(xué)院和澳大利亞納米醫(yī)學(xué)中心（Australian Centre for Nanomedicine，ACN）的研究人員在Nature Reviews Bioengineering期刊上發(fā)表了一篇題為“Paper-based sensors for bacteria detection”的綜述文章，他們討論了紙基細(xì)菌檢測平臺(tái)，不包括如病毒、寄生蟲和真菌等其它微生物病原體。

重要的是，目前，只有滿足（或接近滿足）以下標(biāo)準(zhǔn)的健康診斷、食品質(zhì)量控制和環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的研究被包含在內(nèi)：傳感器可以評(píng)估未經(jīng)處理或未加工的樣品，在資源匱乏的環(huán)境中滿足可現(xiàn)場部署即時(shí)檢測的REASSURED標(biāo)準(zhǔn)，并在相關(guān)實(shí)際范圍內(nèi)達(dá)到檢測限（LOD）。對于后一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，重點(diǎn)將放在實(shí)現(xiàn)小于102菌落形成單位（CFU）?/ml的低檢測限。同時(shí)，研究人員總結(jié)了紙基細(xì)菌檢測平臺(tái)面臨的主要挑戰(zhàn)。

注：REASSURED是Real-time connectivity, Ease of specimen collection, Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid/Robust, Equipment-free and Deliverable首字母縮寫。

紙基傳感技術(shù)發(fā)展時(shí)間線

紙基傳感平臺(tái)

紙基傳感器的一個(gè)重要特點(diǎn)是，其可以通過毛細(xì)管流動(dòng)自發(fā)地輸送液體，因此不需要泵。此外，紙基傳感器易于調(diào)節(jié)紙張孔徑，以改變流速，并且紙張具有高的表面積與體積比，可使試劑固定和儲(chǔ)存。最受歡迎的紙基傳感平臺(tái)是基于比色法的橫向流動(dòng)分析（LFA）。通常，橫向流動(dòng)分析由樣品墊、共軛墊、檢測墊和吸收墊等組成。

商用紙基傳感器

針對標(biāo)準(zhǔn)的夾心免疫測定，首先需將樣品引入樣品墊以啟動(dòng)吸收過程。然后樣品移向共軛墊，與標(biāo)記的檢測生物受體（通常是納米粒子偶連的抗體）相互作用。在進(jìn)一步遷移后，樣品到達(dá)檢測墊，檢測墊包含一條測試線（捕獲的生物受體與標(biāo)記的分析物結(jié)合），以及一條對照線。最后，吸收墊吸收多余的樣品，并規(guī)定測試所需的樣品體積。紙基微流控分析裝置遵循類似的機(jī)制，并受益于簡單的設(shè)計(jì)、低廉的成本和5~30分鐘的快速響應(yīng)時(shí)間，具體取決于樣品特性和應(yīng)用場景。相比之下，盡管敏感性相當(dāng)，基于電化學(xué)的技術(shù)研究卻有所下降，可能由于其成本較高。

研究人員注意到，不同的應(yīng)用需要不同的采樣方法（破壞性或非破壞性）、質(zhì)量保證和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。例如，在固態(tài)食物樣品中，病原體不像在液態(tài)樣品中分布的那樣均勻。本文中，研究人員將嚴(yán)格滿足使用未加工樣品、即時(shí)檢測適用性和證明相關(guān)檢測限標(biāo)準(zhǔn)的研究，根據(jù)樣品的固體、液體和氣體狀態(tài)對其進(jìn)行分組。該應(yīng)用將從臨床診斷到食品和環(huán)境中的病原體檢測。

紙基傳感器的操作過程

固態(tài)樣品

用于固態(tài)樣品（如牛肉、海鮮、面包和生菜）中細(xì)菌檢測的紙基傳感平臺(tái)大多是基于比色的橫向流動(dòng)分析。這些傳感器對用戶很友好，適用于資源匱乏環(huán)境中的即時(shí)檢測應(yīng)用。研究人員基于橫向流動(dòng)分析結(jié)合擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)了幾種平臺(tái)，例如用于細(xì)菌檢測的聚合酶鏈反應(yīng)、表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）或免疫磁性分離（IMS）等平臺(tái)。他們還開發(fā)了使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）或紙基酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的其它方法。然而，此類方法需要加熱，并且需集中在實(shí)驗(yàn)室處理，同時(shí)需要多個(gè)處理步驟，盡管該類系統(tǒng)更加復(fù)雜，但其靈敏度并不比簡單的替代方案低多少（102~10?菌落形成單位/ml）。

雖然CRISPR-Cas紙基細(xì)菌檢測分析受益于固態(tài)樣品的低檢測限（1~102菌落形成單位/ml），但它們需要重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）或重組酶輔助擴(kuò)增（RAA）方法。這些步驟需在37°C~42°C間進(jìn)行，與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的60°C相比，更接近室溫，然而，仍需要電源。此外，擴(kuò)增組分（如Cas蛋白和引物）需要儲(chǔ)存在遠(yuǎn)低于冰點(diǎn)的溫度（零下20?°C）下，這意味著基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和基于CRISPR的方法在其當(dāng)前狀態(tài)下，并不符合所有的REASURED標(biāo)準(zhǔn)。

液態(tài)樣品

與固態(tài)樣品類似，針對液態(tài)樣品（如血清、牛奶、水、果汁和嬰兒配方奶粉溶液）中的細(xì)菌，研究人員主要使用基于橫向流動(dòng)分析的比色法檢測，因其簡單易行。其中大多數(shù)分析依賴于金納米顆粒作為信號(hào)探針，但它們受到高檢測限的限制（大于103菌落形成單位/ml?），或需要樣品預(yù)處理的限制。為了提高其性能，基于橫向流動(dòng)的分析已與磁性納米顆粒等擴(kuò)增方法相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物（例如顯色物質(zhì)和酶）預(yù)濃縮，或?qū)嵤┚酆厦告湻磻?yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增以及基于CRISPR-Cas的方法。然而，這些方法都受到以下一個(gè)或多個(gè)因素限制，例如高溫、長響應(yīng)時(shí)間、低靈敏度、大量樣品制備和擴(kuò)增步驟等。

氣態(tài)樣品

在空氣懸浮液中也可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，將其稱為生物氣溶膠。由于樣品的性質(zhì)，分析通常包括兩個(gè)主要步驟：收集和檢測。收集可通過沉淀、過濾、離心、沖擊、撞擊或微流控芯片實(shí)現(xiàn)。例如，帶有細(xì)菌的空氣樣品可以通過紙基裝置上的多孔采樣墊。然后在取樣墊上使用干燥的裂解緩沖液裂解收集到的細(xì)菌，釋放DNA分子，然后通過水介導(dǎo)的側(cè)向流將其輸送至結(jié)合墊。這種測定的一個(gè)限制是，需要使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)分析得到的等分試樣。

總而言之，紙基分析平臺(tái)的簡單性和低成本引發(fā)了大量關(guān)于細(xì)菌檢測的研究。與電化學(xué)、熒光或化學(xué)發(fā)光方法相比，大部分此類裝置使用比色法作為分析技術(shù)。這種基于紙張的診斷工具在即時(shí)檢測應(yīng)用方面具有巨大潛力，但為了滿足REASSURED標(biāo)準(zhǔn)，仍有幾個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)需要解決。特別是，考慮到特定的細(xì)菌和應(yīng)用，需要改進(jìn)檢測限。選擇性可以通過對樣品中經(jīng)常存在的目標(biāo)化合物的干擾實(shí)驗(yàn)來解決，例如，對于臨床診斷，應(yīng)使用微生物群落背景和血清蛋白作為對照。在食品樣品中，氨基酸、蛋白質(zhì)和脂肪酸會(huì)干擾測定，而在農(nóng)業(yè)樣品中，土壤和植物蛋白質(zhì)會(huì)影響測定。

此外，大多數(shù)研究通常評(píng)估其平臺(tái)對其它致病菌的選擇性。評(píng)估屬或菌株水平的選擇性以減少假陽性結(jié)果也很重要。細(xì)菌對環(huán)境或物理壓力的反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致其表型狀態(tài)或代謝活性的變化。因此，未來的研究，特別是那些依賴代謝釋放的副產(chǎn)物（如揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOC）和抗微生物菌株）的研究，必須定期校準(zhǔn)，以明確這些變化，避免檢測錯(cuò)誤。此外，為了確保測量的準(zhǔn)確性，需要考慮蛋白質(zhì)水平、粘度和pH值。

審核編輯：劉清