構(gòu)建一種基于噬菌體的新型納米生物傳感器

病原微生物的早期和快速檢測對于解決嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題至關(guān)重要。據(jù)麥姆斯咨詢報道，近日，埃及澤維爾科技城（Zewail City of Science and Technology）的科技大學(xué)（UST）及微生物學(xué)和噬菌體治療中心（Center for Microbiology and Phage Therapy）的研究人員構(gòu)建了一種基于噬菌體的新型納米生物傳感器，該傳感器對電化學(xué)阻抗測量法進(jìn)行了大量優(yōu)化，并將其應(yīng)用于食品樣品中大腸桿菌O157:H7的定量檢測。研究人員利用循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）確定了使用由金納米顆粒（AuNP）、多壁碳納米管（MWCNT）和氧化鎢（WO3）納米結(jié)構(gòu)組成的納米復(fù)合材料對一次性絲網(wǎng)印刷電極電化學(xué)性能的影響。納米材料的使用使其對靶向細(xì)菌宿主細(xì)胞具有很高的捕獲靈敏度，其檢測限（LOD）為3.0菌落形成單位（CFU）/ml。

此外，研究人員利用共價固定化活性噬菌體對幾種非靶向細(xì)菌菌株的選擇性進(jìn)行了測試，獲得了較高的特異性。在食品樣品中以高特異性成功地檢測到目標(biāo)食源性病原體，該傳感器提供了90%~108%的優(yōu)良回收率。因此，新開發(fā)的噬菌體生物傳感器被作為一次性無標(biāo)記阻抗生物傳感器，用于快速和實時監(jiān)測食品質(zhì)量。

阻抗測量是一種無標(biāo)記、高度敏感且不受復(fù)雜樣品基質(zhì)中混濁或有色組分影響的技術(shù)，其在此實現(xiàn)了構(gòu)建用于快速細(xì)菌識別的強大噬菌體納米傳感器。T4型噬菌體（ZCEC5）因其對大腸桿菌O157:H7的全細(xì)胞檢測的高靈敏度和選擇性，被選為活性生物識別元件。

為了將活性噬菌體有效地共價固定在用納米材料修飾的傳感器表面上，研究人員將4-氨基硫酚（4-ATP）自組裝到納米結(jié)構(gòu)表面上，進(jìn)而與戊二醛鏈活化以形成定向良好的自組裝單分子層（SAM），如圖1所示。同時，研究人員對其進(jìn)行了電化學(xué)表征（圖2A和2B），其中循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗譜測量表明，納米復(fù)合材料的摻入致使協(xié)同電化學(xué)增強（標(biāo)準(zhǔn)氧化還原探針的氧化還原反應(yīng)速率增加），這是由于氧化鎢和碳納米管具有較高的導(dǎo)電性、電催化活性及其表面積的擴大。同時，電化學(xué)阻抗譜數(shù)據(jù)證實了納米復(fù)合材料對于降低阻抗信號的重要性，這是由于電子從溶液界面向電極表面的轉(zhuǎn)移速度加快了。

圖1 用于大腸桿菌快速阻抗檢測的噬菌體生物傳感方法的后續(xù)制作過程

圖2 （A）作為標(biāo)準(zhǔn)氧化還原探針的鐵氰化物（FCN，5 mMol）氧化還原反應(yīng)電極表面的循環(huán)伏安響應(yīng)；（B）作為標(biāo)準(zhǔn)氧化還原探針的鐵氰化物（FCN，5mMol）氧化還原反應(yīng)電極表面的阻抗響應(yīng)；（C）活性噬菌體固定前后電極表面的阻抗響應(yīng)；（D）基于噬菌體的納米生物傳感器制備步驟的FTIR光譜。

研究人員在四種不同的條件下，測試了將固定化噬菌體與其靶向宿主（大腸桿菌O157:H7）之間的選擇性結(jié)合相互作用轉(zhuǎn)化為可測量和可量化的阻抗信號。噬菌體傳感器對細(xì)菌懸浮液的捕獲效率是在沒有氧化還原介質(zhì)的磷酸鹽緩沖液（PBS，作為唯一電解質(zhì)）中測量的，或使用包括鐵氰化物或2,6-二氯靛酚鈉（DCIP）的單一介質(zhì)測量。最終，研究人員應(yīng)用了兩種介質(zhì)（DCIP/FCN）的組合。結(jié)果表明，當(dāng)使用雙介導(dǎo)系統(tǒng)（DCIP/FCN）時，獲得了代表最高靈敏度的最高阻抗信號。如圖3A所示，僅使用鐵氰化物，以及在沒有任何氧化還原介質(zhì)的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜測量，奈奎斯特圖均未顯示出任何顯著變化。因此，研究人員才選擇了雙介導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 （A）電化學(xué)阻抗譜奈奎斯特圖顯示噬菌體傳感器對所選病原體菌株的捕獲效率；（B）傳感時間對噬菌體生物傳感器產(chǎn)生電化學(xué)阻抗譜信號的影響。

針對噬菌體生物傳感器的選擇性和效率，研究人員在多細(xì)菌濃度范圍內(nèi)（從101~10? CFU/ml）進(jìn)行了評估，同時記錄了每種濃度的電化學(xué)阻抗譜，如圖4A奈奎斯特圖所示。結(jié)果表明，細(xì)菌濃度的增加與阻抗信號的增加有強相關(guān)性，如圖4B所示。為了提取圖中的Rct值，研究人員對特定的等效電路進(jìn)行了建模（圖4C）。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到10? CFU/ml時，該傳感器表面發(fā)生的連續(xù)結(jié)合事件導(dǎo)致的Rct增加值達(dá)到最大。在該濃度下，該傳感器達(dá)到了一種表面飽和水平，這是噬菌體傳感器捕獲目標(biāo)宿主細(xì)胞的最大容量。該研究的檢測限為3.0 CFU/ml，達(dá)到了極高的靈敏度。

圖4 （A）由發(fā)生在噬菌體生物傳感器表面的成功結(jié)合事件產(chǎn)生的阻抗校準(zhǔn)曲線的奈奎斯特圖；（B）Rct值變化與細(xì)菌計數(shù)增加的關(guān)系；（C）用于提取電化學(xué)阻抗譜參數(shù)的Randles等效電路。

由于生物識別元件的選擇對于提供最大的選擇性和特異性始終是很必要的，因此針對新開發(fā)的基于噬菌體的生物傳感器的生物傳感性能，在許多其它細(xì)菌菌株中也進(jìn)行了測試，如圖5所示。結(jié)果顯示，當(dāng)測試外來細(xì)菌菌株時，該傳感器獲得了高選擇性，而響應(yīng)并不顯著。因此，該噬菌體作為生物識別元件為靶向生物體提供了快速、選擇性和定量的阻抗測量檢測。

圖5 基于噬菌體的生物傳感器對靶向和非靶向菌株的阻抗響應(yīng)

為了確?；谑删w的生物傳感器可用于樣品分析，研究人員對各種食品樣品（包括牛肉、白奶酪、番茄汁、自來水和午餐牛肉樣品等）的合成細(xì)菌污染（將大腸桿菌O157:H7以103 CFU/ml的濃度加入食品樣品）進(jìn)行了測試。同時，未感染（未污染）的樣本也作為陰性對照納入該測試。針對每個樣品，研究人員使用單獨的傳感器芯片，并計算ΔRct的變化。進(jìn)行該試驗的同時，研究人員進(jìn)行了CFU平板計數(shù)來驗證。獲得了90%~100%的回收率。

綜上所述，隨著高傳染性菌株的不斷出現(xiàn)和細(xì)菌感染的增加，電化學(xué)納米生物傳感器的開發(fā)通常僅用于一次性測試，以提供快速的現(xiàn)場檢測，免除傳感器的清潔程序同時避免交叉污染。本文中，研究人員使用由金、氧化鎢和多壁碳納米管（Au/WO3/MWCNT）組成的納米復(fù)合材料對一次性絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行功能化，以提供高電催化和電化學(xué)讀數(shù)。

作為一種生物識別元件，裂解噬菌體（大腸桿菌T4型病毒）被共價固定在納米傳感器的表面，該傳感器與4-氨基硫酚和戊二醛的自組裝單分子層交聯(lián)。研究人員采用伏安法和阻抗法對樣品進(jìn)行電化學(xué)表征，用阻抗法對樣品進(jìn)行了分析優(yōu)化和實際樣品分析。基于噬菌體的生物傳感器提供的高靈敏度和選擇性，成功地對食品樣品進(jìn)行了分析。因此，該生物傳感器非常有前途，并為使用一次性和現(xiàn)場設(shè)備進(jìn)行病原體診斷開辟了一條新途徑。

審核編輯：劉清