磁珠的構(gòu)成、吸附DNA的原理

磁珠的構(gòu)成

一般磁珠由三層構(gòu)成，最里面是聚苯乙烯，外面包裹一層磁性物質(zhì)四氧化三鐵，最外面再包一層官能基團(tuán)修飾的高分子材料，上面偶聯(lián)不同的官能團(tuán)。不同功能的磁珠，偶聯(lián)的官能團(tuán)不同，純化核酸用的一般是羧基（-COOH）。

磁珠結(jié)構(gòu)示意圖

當(dāng)然不僅磁珠應(yīng)用在核酸制備上，在化學(xué)發(fā)光、細(xì)胞分選、蛋白純化等應(yīng)用磁珠依然是大顯身手，是因?yàn)椴煌墓倌芑鶊F(tuán)，或者偶聯(lián)其他，如蛋白抗體等。

磁珠吸附DNA的原理

NGS上用的最多還是貝克曼的XP磁珠。這種羧化磁珠比羥基磁珠產(chǎn)量更高，非特異性結(jié)合更少。(Solid-phase reversible immobilization，SPRI）：

（1）反應(yīng)體系中，較高濃度的 PEG 和 NaCl 導(dǎo)致 DNA 分子水化層脫去，DNA膠體熱力學(xué)穩(wěn)定性破壞，構(gòu)象也隨之改變，DNA分子發(fā)生聚集沉淀，帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)大量暴漏在外面；

（2）帶電荷的磷酸基團(tuán)通過(guò) Na^+^與羧基形成“離子橋”，使得 DNA 被特異吸附到帶羧基的磁珠表面。（該過(guò)程是可逆的，在適當(dāng)條件下，結(jié)合的 DNA 分子可以被洗脫回收）

DNA吸附原理圖

純化磁珠進(jìn)行 “片段分選” 的原理

磁珠雙選很大程度依賴于PEG：PEG作為一種分子擁擠試劑，達(dá)到一定的濃度時(shí)，奪取了一定的水，溶液環(huán)境變化，會(huì)使較大DNA的結(jié)構(gòu)變緊湊，發(fā)生坍塌性的轉(zhuǎn)變而凝聚。不同長(zhǎng)度的DNA構(gòu)象穩(wěn)定性不同，在遵循熱力學(xué)規(guī)律的情況下，溶液環(huán)境與分子擁擠試劑的濃度有很大的關(guān)系。即在特定的溶液中，當(dāng)PEG濃度達(dá)到某一臨界值時(shí)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)一定大小以上的DNA分子構(gòu)象非連續(xù)的發(fā)生凝聚。

（1） DNA越長(zhǎng) ：表面裸露出來(lái)帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)越多，整條分子帶的負(fù)電就更強(qiáng)，更容易吸附到磁珠，只需要較低濃度的PEG和NaCl，就可以回收（需要加入的磁珠體積更?。?/p>

（2） DNA越短 ：就需要更高濃度的PEG和NaCl，將其表面的水化層破壞得更徹底，裸露出來(lái)足夠多帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)，才能被磁珠吸附住，從而回收回來(lái)（需要加入的磁珠體積更大）。

磁珠純化圖

此外，體系中的PEG還可以增加溶液的粘稠度，讓磁珠保持懸浮不容易沉聚，在DNA binding過(guò)程中更充分與DNA接觸，同時(shí)PEG也不易造成蛋白變性和非特異性吸附。但是PEG的DNA沉聚效果容易收到pH、溫度等的影響，溫度過(guò)低PEG也不易與水完全互溶，所以磁珠一般都要求室溫平衡后再用，其儲(chǔ)存buffer里也會(huì)加一些低濃度的pH穩(wěn)定劑，如Tris-HCl等。

酒精清洗及DNA洗脫

酒精清洗 ：第一，DNA在這個(gè)濃度的酒精里溶解度很低；第二，DNA這個(gè)時(shí)候是聚集狀態(tài)，磁珠剛好提供一個(gè)聚集的奇點(diǎn)，讓DNA沉聚在其周圍，所以絕大部分DNA不會(huì)掉下來(lái)。但酒精濃度很重要，一般都要求新鮮配制。濃度太低，鹽離子可以清洗得更干凈，但是體系中過(guò)多的水會(huì)將部分DNA從磁珠上溶解下來(lái)，造成DNA損失，DNA的回收率可能會(huì)收到影響。濃度越高，體系中水越少，清洗鹽離子的能力減弱，可能會(huì)使鹽離子清洗不干凈，但DNA的溶解度小，回收率高；

DNA洗脫 ：酒精清理后，先需要晾干磁珠上殘留的酒精，以防影響下游實(shí)驗(yàn)。（注意晾干時(shí)磁珠表面無(wú)光澤即可，過(guò)度干燥，體系失水過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致磁珠DNA進(jìn)一步聚集，最終DNA很難回溶到水中，影響回收率）晾干后加入水或者TE buffer，這時(shí)體系中已經(jīng)沒(méi)有鈉離子和PEG，無(wú)法形成電橋結(jié)構(gòu)，帶負(fù)電的DNA和磁珠之間相排斥，水重新包裹DNA形成水化層，使其從磁珠上洗脫下來(lái)，溶解到溶液中。