衍射編碼雙光子合成孔徑顯微術(shù)，實(shí)現(xiàn)深層活體組織時(shí)空跨尺度觀測(cè)

雙光子顯微鏡是對(duì)深層散射組織進(jìn)行活體觀測(cè)不可或缺的儀器，以其遠(yuǎn)超單光子顯微成像的穿透深度而受到生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的廣泛關(guān)注。然而，傳統(tǒng)雙光子顯微成像的點(diǎn)掃描成像模式從根本上限制了其成像通量與三維感知速度，極易受復(fù)雜活體成像環(huán)境干擾，同時(shí)激發(fā)點(diǎn)巨大的瞬時(shí)光強(qiáng)會(huì)對(duì)活體生物樣本造成持續(xù)性的非線性光損傷，導(dǎo)致高速三維成像時(shí)長(zhǎng)嚴(yán)重受限，極大地制約了病理學(xué)、免疫學(xué)和腦科學(xué)的發(fā)展。

針對(duì)這些難題，2023年5月12日，清華大學(xué)戴瓊海、吳嘉敏、祁海共同通訊在Cell期刊上發(fā)表題為Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue 的研究論文。首次提出了基于空間約束的多角度衍射編碼，實(shí)現(xiàn)非相干光孔徑合成；建立了雙光子合成孔徑顯微術(shù)（Two-photon synthetic aperture microscopy, 2pSAM），“化點(diǎn)為針”，通過多角度針狀光束的掃描在實(shí)現(xiàn)高速三維感知的同時(shí)，將雙光子成像光毒性降低了1000倍以上；融合了戴瓊海院士團(tuán)隊(duì)2021年同樣在Cell期刊上所提出的數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)架構(gòu)，具備高速多區(qū)域像差矯正能力，即使在惡劣復(fù)雜活體環(huán)境下依然保持近衍射極限的空間分辨率，并進(jìn)一步提升了傳統(tǒng)雙光子成像的穿透深度?；诖?，2pSAM能夠在哺乳動(dòng)物深層散射組織中非侵入式地觀測(cè)大范圍亞細(xì)胞級(jí)動(dòng)態(tài)變化，將毫秒級(jí)三維連續(xù)觀測(cè)時(shí)長(zhǎng)從數(shù)分鐘提高到數(shù)十小時(shí)，為系統(tǒng)性地研究大規(guī)模細(xì)胞在不同生理與病理狀態(tài)下的交互作用打開了大門。交叉研究團(tuán)隊(duì)利用2pSAM在小鼠活體觀測(cè)到了一系列新現(xiàn)象，包括急性腦損傷后腦組織內(nèi)周的多細(xì)胞互作，神經(jīng)元在超長(zhǎng)時(shí)程連續(xù)觀測(cè)下展現(xiàn)出對(duì)視覺刺激的表征穩(wěn)定性與功能多樣性，以及首次完整高速記錄下了小鼠免疫反應(yīng)過程中淋巴結(jié)生發(fā)中心的形成過程，為病理學(xué)、腦科學(xué)和免疫學(xué)的研究打開了新窗口。

傳統(tǒng)雙光子顯微鏡使用“點(diǎn)掃描”的方案對(duì)三維樣本進(jìn)行掃描，類似于共聚焦熒光顯微鏡，由于雙光子成像的非線性效應(yīng)使其能夠獲得數(shù)倍于單光子成像的穿透深度。例如，雙光子顯微鏡在小鼠大腦皮層的最大穿透深度可以達(dá)到1 mm。然而，這種點(diǎn)掃描方式嚴(yán)重限制了雙光子顯微鏡的三維成像速度與數(shù)據(jù)通量，并且由于在聚焦點(diǎn)位置極大的瞬時(shí)光強(qiáng)帶來了非常嚴(yán)重的非線性光損傷隱患。2pSAM采用了軸向景深拓展的“針掃描”方案，通過改變針狀光束的不同傾角實(shí)現(xiàn)樣本三維信息的多角度投影，類似CT一樣實(shí)現(xiàn)快速三維成像；同時(shí)，受到雷達(dá)成像中合成孔徑方法的啟發(fā)，通過在像面處引入針孔所帶來的空間衍射編碼約束，實(shí)現(xiàn)了非相干光的孔徑合成，將多角度信息融合為大數(shù)值孔徑對(duì)應(yīng)的高空間分辨率；進(jìn)一步利用樣本的時(shí)空連續(xù)性先驗(yàn)，有效避免了視角掃描帶來的時(shí)間分辨率損失。這樣一種全新的計(jì)算雙光子成像架構(gòu)，在保留雙光子本身深層組織穿透能力的同時(shí)，將有效成像通量提升了三個(gè)數(shù)量級(jí)以上。

圖1雙光子合成孔徑顯微術(shù)（2pSAM）系統(tǒng)圖

除此之外，樣本引起的光學(xué)像差給顯微成像帶來的分辨率與信噪比損失十分嚴(yán)重，隨著成像深度的增加這種降質(zhì)尤為明顯。目前雙光子成像中的硬件自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)主要面臨著以下一些問題：1、成像系統(tǒng)復(fù)雜、成本高昂；2、有效校正視場(chǎng)有限，大視場(chǎng)多區(qū)域校正速度緩慢。2pSAM通過激發(fā)光編碼獲得了超精細(xì)的四維空間角度光場(chǎng)數(shù)據(jù)，能夠使用數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)架構(gòu)（DAO），無需在光學(xué)系統(tǒng)中增加額外的波前傳感器或者空間調(diào)制器，就能實(shí)現(xiàn)信號(hào)采集與自適應(yīng)像差校正的解耦，在后處理端完成大范圍多區(qū)域自適應(yīng)光學(xué)，顯著提升在復(fù)雜成像環(huán)境中的空間分辨率與信噪比。

圖2 雙光子合成孔徑顯微術(shù)（2pSAM）結(jié)合數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)（DAO）與傳統(tǒng)雙光子顯微鏡（TPM）面對(duì)復(fù)雜成像條件下的結(jié)果對(duì)比。從左至右依次為：正常條件下拍攝，物鏡校正環(huán)不匹配情況下拍攝，物鏡為水鏡且缺乏浸潤(rùn)水的情況下拍攝，物鏡與樣本之間增加散射膠帶后進(jìn)行拍攝。

長(zhǎng)時(shí)間的激光照射會(huì)對(duì)活體樣本產(chǎn)生嚴(yán)重的光毒性。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)雙光子顯微成像由于使用飛秒激光激發(fā)與高NA會(huì)聚，在樣本局部會(huì)產(chǎn)生巨大的瞬時(shí)光強(qiáng)，由此所產(chǎn)生的非線性光毒性在以往被極大地低估了，而一旦在長(zhǎng)時(shí)程成像過程中，就會(huì)不斷積累損傷從而影響細(xì)胞正常狀態(tài)。與之對(duì)比，2pSAM化點(diǎn)為針，通過軸向景深拓展，在保持同樣熒光激發(fā)效率的前提下，將瞬時(shí)峰值功率降低了1000倍，從而有效解決了非線性光損傷的問題。一方面能顯著減少熒光探針的光漂白，對(duì)于同一類易淬滅染料，在同樣激發(fā)光強(qiáng)下，傳統(tǒng)雙光子僅能拍攝幾十個(gè)三維體，而2pSAM能夠連續(xù)拍攝幾十萬個(gè)三維體而沒有明顯的信號(hào)衰減。除此之外，團(tuán)隊(duì)還對(duì)小鼠腦皮層中的小膠質(zhì)細(xì)胞與腦損傷過程中的中性粒細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)成像測(cè)試，發(fā)現(xiàn)即使使用較弱的光強(qiáng)，傳統(tǒng)雙光子顯微成像在連續(xù)拍攝半小時(shí)以上時(shí)仍會(huì)導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡，而在2pSAM成像過程中細(xì)胞保持了正常的表型，并且相比于對(duì)照組結(jié)果無明顯差異。團(tuán)隊(duì)通過一系列在體與離體實(shí)驗(yàn)充分證明了2pSAM能夠?qū)鹘y(tǒng)雙光子成像的光毒性下降三個(gè)數(shù)量級(jí)以上，為長(zhǎng)時(shí)程高速活體組織成像打開了新窗口。

圖3 小鼠大腦急性開窗損傷后的皮層免疫細(xì)胞成像，TPM（左）與2pSAM（右）光漂白對(duì)比。

圖4 離體B細(xì)胞（GFP，藍(lán)色通道）連續(xù)拍攝實(shí)驗(yàn)：使用PI標(biāo)記細(xì)胞凋亡（紅色通道），對(duì)比TPM（左）與2pSAM（右）的光毒性。

生發(fā)中心（Germinal center, GC）是次級(jí)淋巴器官中的動(dòng)態(tài)組織區(qū)域，是被抗原激活后的B細(xì)胞在趨化作用引導(dǎo)下聚集形成的結(jié)構(gòu)，也是產(chǎn)生高親和力抗體及形成長(zhǎng)期免疫記憶關(guān)鍵場(chǎng)所。但是由于GC形成的隨機(jī)性和免疫細(xì)胞本身對(duì)光損傷的敏感性，完整的GC形成過程從未被高速長(zhǎng)時(shí)間的清晰記錄過。借助2pSAM，得以首次完整清晰地觀測(cè)到了免疫反應(yīng)下GC形成的全部過程。研究人員將帶有熒光標(biāo)記的抗原特異性B細(xì)胞回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)，隨后將抗原接種到腹股溝附近以誘導(dǎo)引流淋巴結(jié)中生發(fā)中心的形成，并于免疫后90到110個(gè)小時(shí)內(nèi)（生發(fā)中心未形成期），在大視場(chǎng)下持續(xù)地對(duì)淋巴結(jié)中抗原特異性B細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行追蹤，成功揭示了GC形成過程中B細(xì)胞的分裂增殖是GC形成的主因，輔助以周圍活化B細(xì)胞的聚集。由于拍攝時(shí)長(zhǎng)達(dá)十余小時(shí)，淋巴結(jié)本身會(huì)產(chǎn)生劇烈的形變，2pSAM通過多視角信息能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)軸向聚焦位置反饋，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)對(duì)焦，有效避免了長(zhǎng)時(shí)程拍攝過程中的樣本漂移。

圖5 小鼠腹股溝淋巴結(jié)免疫反應(yīng)后生發(fā)中心形成過程的完整觀測(cè)和記錄

研究人員進(jìn)一步借助2pSAM在患有創(chuàng)傷性大腦損傷（Traumatic brain injury, TBI）的小鼠和正在接受視覺條紋刺激的GCaMP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行腦皮層組織的細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)。在TBI小鼠受傷區(qū)域磨薄顱骨后觀測(cè)到了外周免疫細(xì)胞中性粒細(xì)胞在浸潤(rùn)后與內(nèi)周星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，如通過直接接觸定向產(chǎn)生遷移體（migrasome）來傳遞物質(zhì)和信息。對(duì)GCaMP轉(zhuǎn)基因小鼠開顱恢復(fù)2周后進(jìn)行視覺上的條紋刺激，進(jìn)一步證實(shí)了長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)內(nèi)小鼠視覺皮層神經(jīng)元鈣信號(hào)對(duì)不同方向條紋選擇性表達(dá)的持續(xù)性和穩(wěn)定性，同時(shí)也通過長(zhǎng)時(shí)程功能數(shù)據(jù)挖掘出了多種單細(xì)胞水平的神經(jīng)響應(yīng)類型，體現(xiàn)了神經(jīng)元的功能多樣性。這些現(xiàn)象對(duì)于傳統(tǒng)雙光子顯微鏡而言都極具挑戰(zhàn)，特別是會(huì)由于光毒性本身導(dǎo)致會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常表現(xiàn)，比如會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元在長(zhǎng)時(shí)程拍攝過程中響應(yīng)強(qiáng)度不斷下降。

清華大學(xué)自動(dòng)化系博士生趙志鋒、周逸亮、醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系博士后劉波、自動(dòng)化系博士后賀敬為該論文的共同第一作者，清華大學(xué)自動(dòng)化系、腦與認(rèn)知科學(xué)研究院、清華-IDG/麥戈文腦科學(xué)研究院戴瓊海教授，吳嘉敏助理教授，醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系祁海教授為論文共同通訊作者，趙家胤、蔡燁怡、范靜濤、李欣陽、王紫霖、盧志參與并做出重要貢獻(xiàn)。

原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.04.016

審核編輯 ：李倩