用于超高通量篩選的熒光偶聯(lián)液滴微流控策略研究進(jìn)展

近十年來，熒光激活液滴分選技術(shù)（FADS）快速發(fā)展，已成為一種強(qiáng)大的超高通量篩選工具，廣泛應(yīng)用于酶、代謝產(chǎn)物和抗體篩選。

高靈敏度熒光偶聯(lián)策略（FCSs）是FADS應(yīng)用拓展的關(guān)鍵技術(shù)，可將酶活性、代謝產(chǎn)物濃度、抗體親和力等性質(zhì)與熒光信號進(jìn)行偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)定量檢測，是FADS應(yīng)用發(fā)展關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

截止目前，一系列FCSs已經(jīng)被開發(fā)，極大地擴(kuò)展了FADS的應(yīng)用（圖1）。



圖1FADS系統(tǒng)工作流程圖

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近日，中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所醫(yī)藥酶工程研究中心馬富強(qiáng)研究員團(tuán)隊在國際TOP期刊Biotechnology Advances上發(fā)表了題為“Fluorescence coupling strategies in fluorescence-activated droplet sorting (FADS) for ultrahigh-throughput screening of enzymes, metabolites, and antibodies”的綜述論文。

該綜述系統(tǒng)性回顧了十多年來不同分析物質(zhì)（酶、代謝產(chǎn)物、抗體）熒光偶聯(lián)液滴微流控研究的最新進(jìn)展，并根據(jù)熒光偶聯(lián)策略原理，將其分為四大類，包括熒光底物分析策略、酶聯(lián)熒光分析策略、基于生物傳感器的熒光偶聯(lián)策略、基于抗體親和力的熒光偶聯(lián)策略。作者分別介紹了四類FADS的原理，并將各類策略液滴微流控研究進(jìn)展進(jìn)行了分析和總結(jié)。

熒光底物分析策略是酶篩選中最常用的熒光偶聯(lián)方法之一。通過將熒光團(tuán)與特定的官能團(tuán)共價結(jié)合，以阻止其產(chǎn)生熒光信號。當(dāng)目標(biāo)酶催化熒光底物釋放官能團(tuán)，生成的熒光團(tuán)產(chǎn)生熒光信號，其信號強(qiáng)度應(yīng)與酶活性成線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。

在過去十年中，已有多種熒光底物被設(shè)計、開發(fā)并應(yīng)用于類酶活性檢測中，包括水解酶、氧化還原酶、和裂解酶等（表1）。與此同時，熒光底物策略可用于宏基因組文庫篩選或者難以培養(yǎng)的細(xì)菌群體中鑒定新的酶、新進(jìn)化的催化酶。

表1 熒光底物策略在酶篩選中應(yīng)用案例

FADS技術(shù)可以從大型突變庫或難以培養(yǎng)的混合環(huán)境樣品中篩選出所需的酶或細(xì)胞，但這些篩選所針對的大多數(shù)自然酶或代謝產(chǎn)物都是非熒光性的，不適合FADS系統(tǒng)。酶聯(lián)熒光分析策略成為FADS應(yīng)用另一關(guān)鍵技術(shù)，可將非熒光代謝產(chǎn)物的濃度或酶活力轉(zhuǎn)化為熒光信號，實(shí)現(xiàn)熒光定量檢測。

該綜述對一系列的酶，如氧化酶、還原酶以及轉(zhuǎn)移酶等，偶聯(lián)相應(yīng)底物特異性氧化酶，實(shí)現(xiàn)酶活力或代謝產(chǎn)物濃度分析和檢測（表2）。

表2 酶聯(lián)熒光策略在酶及代謝產(chǎn)物生產(chǎn)菌株篩選中的應(yīng)用案例

生物傳感器是基于目標(biāo)分析物與檢測信號成線性關(guān)系，通過信號強(qiáng)度進(jìn)行分析、檢測、定量的一類裝置。熒光生物傳感器是一種基于熒光分子產(chǎn)生信號的生物傳感器，可設(shè)計多種識別元件，包括適配體、抗體、酶等。其中，適配體由RNA或DNA寡核苷酸構(gòu)成，可特異性地結(jié)合目標(biāo)分子，是生物傳感器理想的識別元件。

將熒光分子納入設(shè)計中，在熒光強(qiáng)度發(fā)生變化時可以監(jiān)測目標(biāo)分子與識別元件的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的實(shí)時檢測和定量分析。這些生物傳感器在多種場合中均有應(yīng)用，包括體外試驗(yàn)和體內(nèi)成像。基于此，該綜述主要介紹了基于轉(zhuǎn)錄因子（TF）的熒光生物傳感器（即基于抑制型-或激活熒光生物傳感器）、基于RNA的熒光生物傳感器以及基于FRET的熒光生物傳感器，有效地將目標(biāo)分析物濃度及性質(zhì)轉(zhuǎn)化為FADS超高通量篩選中的熒光信號。

表3 基于生物傳感器熒光偶聯(lián)策略在酶及代謝產(chǎn)物生產(chǎn)菌株篩選中的應(yīng)用案例

抗體廣泛用于研究和臨床診斷，并用于治療各種疾病。近年來，治療性單克隆抗體數(shù)量在市場上顯著增加。2021年全球單克隆抗體市場規(guī)模為1144.3億美元，預(yù)計到2025年將增長至1795.6億美元，年增長率（CAGR）估計為2021年至2025年11.9%。2022年全球銷售最高的藥物中有幾種是抗體藥物，包括Humira、Keytruda、Stelara和Opdivo。這凸顯了抗體作為治療感染、自身免疫和腫瘤性疾病的強(qiáng)效治療劑的重要性。單克隆抗體可以通過噬菌體展示和相關(guān)技術(shù)高效篩選結(jié)合。

然而，由于常規(guī)雜交瘤篩選中只能容納幾千個克隆體，成本高、通量低。FADS在抗體篩選應(yīng)用中優(yōu)勢突出，皮升或納升級別的反應(yīng)體系降低了成本并增加了通量，使得抗體分泌的定量、高靈敏度、實(shí)時動力學(xué)測量成為可能。本綜述中，基于抗體親和力作用，分別介紹了熒光聚集分析技術(shù)、酶活性抑制分析技術(shù)、親和力響應(yīng)報告細(xì)胞分析技術(shù)在功能性抗體篩選中的應(yīng)用及拓展。

圖2 基于抗體親和力熒光偶聯(lián)策略在抗體篩選中的應(yīng)用案例示意圖

綜上所述，作者綜述了不同類型熒光偶聯(lián)策略及其應(yīng)用發(fā)展，為液滴微流控系統(tǒng)在酶、代謝產(chǎn)物及抗體篩選應(yīng)用拓展提供了重要的基礎(chǔ)理論依據(jù)。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會會員資助計劃等資助。

審核編輯：劉清