核酸適配體檢測(cè)原理 可生成具有所需結(jié)合親和力的適配體

核酸適配體是一種短的單鏈DNA或RNA分子，其具有穩(wěn)定性高、結(jié)合能力強(qiáng)、便于修飾、成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于制作各種靶標(biāo)分子的生物傳感器。傳統(tǒng)的適配體篩選采用指數(shù)富集法（SELEX），即通過反復(fù)的篩選和擴(kuò)增，從單鏈寡核苷酸庫中富集出與靶標(biāo)結(jié)合的適配體。該方法無法定量生產(chǎn)所需結(jié)合親和力的適配體，且耗時(shí)耗力。近些年來研究者們開發(fā)了如CE-SELEX、Non-SELEX以及M-SELEX等技術(shù)，提高了適配體的篩選效率，但仍無法定量生成具有特定結(jié)合親和力的適配體。

近期，美國西北大學(xué)的Shana O. Kelley教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為“Pro-SELEX”的新方法，用于定量分離具有可編程結(jié)合親和力的適配體。該工作以“A high-dimensional microfluidic approach forselection of aptamers with programmable binding affinities”為題，發(fā)表在Nature Chemistry期刊上。

Pro-SELEX的整體流程如圖1a所示，首先將單鏈寡核苷酸庫轉(zhuǎn)化為單克隆適配體粒子（AP），在每個(gè)粒子的表面展示了單個(gè)核酸序列的多個(gè)拷貝，產(chǎn)生AP文庫。然后將其與不同濃度的靶標(biāo)一起進(jìn)行孵育，使用微流控芯片分離具有不同靶結(jié)合水平的AP，進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定出具有不同結(jié)合親和力的適配體。具體的分選方法如圖1b所示，AP文庫與生物素化的靶標(biāo)結(jié)合后，再用抗生物素磁性納米顆粒（MNP）去標(biāo)記靶標(biāo)，將結(jié)合了靶標(biāo)的適配體粒子賦予磁性，隨后送至微流控裝置中分選。該微流控裝置分為四個(gè)區(qū)，當(dāng)外界設(shè)定流量Q相同時(shí)，四個(gè)區(qū)域會(huì)因截面積A的不同而展現(xiàn)出不同的流速V（即Q=A*V）。第一區(qū)流速最大，若適配體與靶標(biāo)結(jié)合能力強(qiáng)，則其磁性高，磁力能夠克服流體高流速產(chǎn)生的拖曳力，則被保留下來。而親和力較低的適配體粒子因磁性較弱，無法克服拖曳力而被帶到下一個(gè)區(qū)域。后三個(gè)區(qū)域流速遞減，同理可根據(jù)不同的親和力進(jìn)行分選（圖1c, d）。該微流控芯片的流量是可調(diào)整的，具備可編程性（圖1e）。

圖1 微流控方法定量分離不同結(jié)合親和力的適配體

接下來，研究人員將該方法用于分選凝血酶適配體。在核酸文庫中，同種適配體對(duì)靶標(biāo)的親和力存在差異。以03適配體為例，研究人員首先測(cè)試了該微流控芯片是否可以分類不同靶結(jié)合水平的AP（圖2a）。將AP與不同濃度的靶標(biāo)共同孵育并用磁珠標(biāo)記（圖2b），分別在兩種不同的流量下對(duì)這些粒子進(jìn)行分選（圖2c、2d）。在8 mL/h的流量下，高磁性粒子主要被捕獲在芯片的1區(qū)，當(dāng)流量增加到16 mL/h時(shí)，部分移動(dòng)到2區(qū)，而低磁性粒子主要聚集在后面的區(qū)，幾乎所有的非靶結(jié)合粒子都在W區(qū)中被檢測(cè)到。上述結(jié)果表明，該微流控芯片能夠根據(jù)AP的靶結(jié)合水平對(duì)其進(jìn)行分類和捕獲，其中靶標(biāo)濃度對(duì)分離效率起著顯著的作用。此外，不同適配體（03和TBA）對(duì)靶標(biāo)的親和力也不同。研究人員分別采用流式細(xì)胞儀（圖2e~2g）及Pro-SELEX芯片篩選（圖2h~2j），結(jié)果也證實(shí)了該芯片能夠分選不同親和力的AP。

圖2 Pro-SELEX分選性能驗(yàn)證

然后，研究人員研究了Pro-SELEX平臺(tái)是否能高效地篩選適配體。以人髓過氧化物酶（MPO）作為模型，AP文庫在5種MPO濃度下以兩種流量進(jìn)行測(cè)試，分離出不同親和力的適配體（圖3a）。結(jié)果表明，該微流控芯片捕獲的AP組分隨著目標(biāo)濃度的降低而減少（圖3b）。而當(dāng)流量升高時(shí)，AP庫的分選布局發(fā)生了變化（圖3c），突出了該方法的高分辨率。隨后，研究人員將收集到的DNA文庫進(jìn)行高通量測(cè)序，并創(chuàng)建了一種評(píng)分工具，用于分析適配體的富集倍數(shù)并產(chǎn)生Z分?jǐn)?shù)（圖3d、3e）。此外，研究人員還隨機(jī)選擇了八種適配體測(cè)定其Kd（圖3f），通過曲線擬合發(fā)現(xiàn)它們的Kd值與Z分?jǐn)?shù)之間存在線性關(guān)系（圖3g），表明Z評(píng)分可用于篩選特定親和力的適配體。

圖3 使用Pro-SELEX篩選MPO適配體

最后，研究人員探究了Z分?jǐn)?shù)是否可以用于定量篩選具有所需結(jié)合親和力的適配體。基于Z分?jǐn)?shù)和適配體的Kd值之間的相關(guān)性產(chǎn)生“檢索帶”（圖4a）。通過評(píng)估不同Z分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)多個(gè)適配體的結(jié)合親和力，“十分匹配”的成功率在20%到50%之間。表明在Z分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)測(cè)試不超過5個(gè)候選適配體，就可識(shí)別出一個(gè)具有所需結(jié)合親和力的適配體（圖4b）。MPO的四種特定親和力的適配體成功被篩選出來（圖4c）。

圖4 定量分選具有所需親和力的MPO適配體

總結(jié)來說，該研究開發(fā)了一種新的適配體篩選方法，其能夠高效、定量地生成具有所需結(jié)合親和力的適配體。Pro-SELEX方法具備可編程性，可捕獲從小分子到病毒或細(xì)菌的各種靶標(biāo)，具備廣闊的應(yīng)用前景。

責(zé)任編輯：彭菁