如何利用微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)血小板在肺血管系統(tǒng)中的高效生成？

血小板由巨核細(xì)胞衍生而來，具有止血作用。骨髓和肺是血栓形成的主要部位，但其機(jī)制尚不清楚。此外，在體外生成的血小板功能性很差。近日，來自英國布里斯托大學(xué)的Alastair W. Poole和Xiaojuan Zhao教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了利用微流控技術(shù)在肺血管系統(tǒng)中高效生成血小板的相關(guān)研究。研究成果以“Highly efficient platelet generation in lung vasculature reproduced by microfluidics”為題發(fā)表在Nature Communications期刊上。

在體外小鼠肺血管中灌注巨核細(xì)胞可產(chǎn)生大量血小板，每個(gè)巨核細(xì)胞可產(chǎn)生多達(dá)3000個(gè)血小板。盡管巨核細(xì)胞體積較大，但它們?nèi)阅芊磸?fù)通過肺血管，在血管中巨核細(xì)胞去核然后生成血小板。通過使用體外人工肺和微流控芯片，該研究明確了氧合、通氣、肺內(nèi)皮和微血管結(jié)構(gòu)是如何支持血栓生成的。此外，還顯示了肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)因子原肌球蛋白4（TMP4）在肺血管血小板形成最后步驟中的關(guān)鍵作用。該研究揭示了肺血管中血栓形成的機(jī)制，并為大規(guī)模生成血小板提供了可靠的方法。

體內(nèi)肺血管中血小板高效生成

研究表明，肺是血小板生成的主要部位之一，但這種血小板生成的機(jī)制并不清楚。該研究在體內(nèi)和體外建立了小鼠心肺模型，通過該模型能夠灌注小鼠巨核細(xì)胞（MKs）。體外小鼠心肺模型的基礎(chǔ)是將心肺分離成一個(gè)整體，結(jié)扎腔靜脈和主動(dòng)脈弓并灌注預(yù)染色的成熟MKs。首先對(duì)肺部進(jìn)行人工通氣。由于MKs體積較大，原設(shè)想絕大多數(shù)MKs會(huì)被困在肺血管中，但第一次超過50%的完整MKs可以出現(xiàn)在灌流液中。灌流液可以通過肺部再次注射，多次注射后，灌流液中完整MKs的數(shù)量繼續(xù)減少。隨著傳代次數(shù)的增加，每個(gè)MK產(chǎn)生的血小板數(shù)量逐漸增加，18次傳代后達(dá)到約931.7 ± 138.4個(gè)血小板/MK。傳代后固定肺切片進(jìn)行雙光子顯微鏡檢查顯示，肺微血管中可見許多生成的血小板。經(jīng)過18次肺部穿刺后，每個(gè)MK產(chǎn)生了約2997.0 ± 270.5個(gè)血小板，即體內(nèi)每個(gè)MK產(chǎn)生約1000 ~ 4000個(gè)血小板?？傊?，在MKs通過肺微血管多次循環(huán)后，可以產(chǎn)生生理數(shù)量的血小板。

圖1 小鼠血小板由通過小鼠肺血管的巨核細(xì)胞生成

圖2 肺內(nèi)皮細(xì)胞健康和微血管結(jié)構(gòu)在血小板生成中的作用

生成的血小板形態(tài)和功能正常

接著研究人員明確心肺系統(tǒng)中生成的血小板是否具有經(jīng)典的形態(tài)和功能。用α-微管蛋白免疫標(biāo)記生成的血小板顯示具有典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的平均大小比對(duì)照組大。根據(jù)生成血小板的直徑范圍，分為兩個(gè)亞群：約33%的生成血小板與對(duì)照血小板大小相似，67%的生成血小板明顯大于對(duì)照血小板。透射電子顯微鏡（TEM）觀察生成血小板的超微結(jié)構(gòu)也顯示：血小板呈盤狀，具有α顆粒、致密顆粒、線粒體、管狀系統(tǒng)和微管線圈等。與尺寸較小的亞群相比，尺寸較大的亞群在整合素αⅡbβ3激活和P-選擇素表達(dá)方面對(duì)凝血酶的反應(yīng)更強(qiáng)。生成血小板和對(duì)照血小板的CD61和CD42b的平均熒光強(qiáng)度（MFI）相當(dāng)。然而，盡管表達(dá)CD61的細(xì)胞比例也相當(dāng)，但與對(duì)照組相比，生成血小板中表達(dá)CD42b的細(xì)胞比例較低。生成的血小板中三種膠原受體CD42d24、CD49b和糖蛋白VI（GPVI）的平均熒光強(qiáng)度（MFI）高于對(duì)照組。對(duì)體外血栓形成進(jìn)行評(píng)估顯示，生成的血小板占據(jù)血栓的所有層面，而對(duì)照組血小板主要位于血栓的頂部，表明生成的血小板對(duì)膠原蛋白有更高的反應(yīng)性，生成的血小板是早期與膠原相互作用的血小板，具有更大的粘附性能。

圖3 生成的血小板具有與正常血小板相似的外觀和功能

巨核細(xì)胞脫核和血小板在血管內(nèi)的釋放

研究人員進(jìn)一步探索反復(fù)通過肺血管時(shí)MKs釋放血小板的過程。結(jié)果顯示在反復(fù)傳代后，MKs的細(xì)胞核逐漸向外周移動(dòng)，隨后去核，產(chǎn)生裸核和去核MKs。雖然發(fā)現(xiàn)了少量有核圓形MKs，但較大的無核物逐漸積累。表明大的多倍體細(xì)胞核在極化過程中從細(xì)胞中心位置向外周移動(dòng)。進(jìn)一步通過肺血管時(shí)，細(xì)胞核從細(xì)胞中擠出，直到第9次傳代時(shí)，有核的MKs所剩無幾。經(jīng)過12次傳代后，大的裸核也變得稀少，取而代之的是不規(guī)則的小亞核。這些亞細(xì)胞核看起來相互連接。子核的特征是深度、長寬比、主軸和次軸都隨傳代的增加而大幅減少。因此，擠出的裸核經(jīng)歷了一個(gè)分裂為多個(gè)組成亞核的過程，這些亞核進(jìn)而凝結(jié)成具有較大圓度的緊湊亞核單位。無核的MK經(jīng)過多次傳代后分裂成血小板，到15 ~ 18次傳代時(shí)達(dá)到高峰。

圖4 巨核細(xì)胞在破碎前出現(xiàn)核邊緣化和去核現(xiàn)象

肺血管中血小板生成需要原肌球蛋白4進(jìn)行調(diào)節(jié)

血小板的釋放涉及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白絲形成共聚物，并以同工酶方式調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的功能。TPM4在血小板形成中發(fā)揮作用，但在體外人工肺系統(tǒng)中，Tpm4-/- MKs在灌流液中不生成血小板。因此，研究人員探索了血小板生成需要TPM4的步驟。與野生型MKs相比，在前3個(gè)傳代期間，較少的Tpm4-/- MKs轉(zhuǎn)變?yōu)榇蟮臒o核物。到6 ~ 9代時(shí)，大核物體的數(shù)量與野生型相當(dāng)。雙光子顯微鏡觀察固定的肺切片顯示，18個(gè)傳代后，出現(xiàn)大量的核熒光物，表明TPM4在調(diào)節(jié)無核化過程中的作用很小且非必要，但在調(diào)節(jié)血小板形成的最后步驟及其釋放到循環(huán)中的過程中起著關(guān)鍵作用。在心肺模型中，TPM4在血小板生成中起著關(guān)鍵作用。接著研究人員研究了Tpm4-/- MKs在骨髓中是否與WT相似。在WT或Tpm4-/-小鼠中，觀察到MKs從骨髓間隙到竇狀的4種不同形態(tài)，在肺血管中，TPM4調(diào)節(jié)約10 μm無核碎片向血小板的轉(zhuǎn)化。此外，TPM4可能在調(diào)節(jié)肺血管以外的器官中生成的血小板最終大小方面起一定作用，因?yàn)門pm4-/-小鼠的血小板體積比野生型小鼠略大。

綜上所述，該研究開發(fā)了一種在體外高效生成血小板的方式，即在通氣條件下通過肺血管反復(fù)注射MKs。此外，還發(fā)現(xiàn)巨核細(xì)胞去核過程、生成血小板的最后步驟以及血小板釋放到循環(huán)中依賴TPM4。這些發(fā)現(xiàn)將為大規(guī)模生產(chǎn)人類血小板提供一個(gè)新方法。





審核編輯：劉清