濱松單相機(jī)雙色同步成像解決方案

??使用靈活之隨意更換濾光片

??W-View GEMINI允許使用者自行更換其中的濾光片以靈活適應(yīng)于各種顏色/波長之間的分光需求。其中的濾光片尺寸為顯微鏡中常用的標(biāo)準(zhǔn)尺寸，最大限度地方便研究者對于濾光片的挑選使用。

????使用靈活之W-View讀出模式

??采用W-View GEMINI這樣的雙色分光附件將兩種顏色的信號成像到一臺相機(jī)的一個(gè)感光芯片上很好地解決了同步成像的時(shí)間問題，但對于絕大多數(shù)的相機(jī)，整個(gè)感光芯片只能設(shè)置一個(gè)曝光時(shí)間，當(dāng)兩個(gè)顏色的信號強(qiáng)度相差較大時(shí)將很難同時(shí)將兩個(gè)顏色的成像信噪比保證在最佳狀態(tài)。

??而濱松Flash 4.0系列sCMOS相機(jī)則可以分別調(diào)整同一芯片上下兩半的曝光時(shí)間，稱為W-View讀出模式。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0系列sCMOS相機(jī)的時(shí)候，我們可以非常靈活地調(diào)整兩個(gè)顏色信號的相對亮度，得到更加能夠突出所需信號和結(jié)構(gòu)的圖片。在兩個(gè)顏色通道的信號差別非常大的時(shí)候，F(xiàn)lash 4.0系列sCMOS相機(jī) + W-View GEMINI這種靈活的曝光時(shí)間設(shè)置就可以針對不同的波長設(shè)置不同的曝光時(shí)間，同時(shí)保證兩個(gè)波長信號的信噪比。

??應(yīng)用之雙色同步高速成像

??濱松W-View GEMINI雙色分光器可以將顯微鏡下同一個(gè)樣品的信號按照波長分別成像到同一臺相機(jī)的兩邊，配合高速高靈敏度的Flash 4.0系列sCMOS相機(jī)就可以做到非常高速的雙色同步成像。下面這個(gè)例子中( Nature Methods (2014) 11:919-922 )，作者在300-500幀/秒單層光片(lightsheet)成像的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了針對斑馬魚心臟的3D高速光片雙色成像。濱松高速高靈敏度的sCMOS相機(jī)Flash 4.0和雙色分光器W-View GEMINI 被用于這一套"high-speed SPIM"系統(tǒng)中。對于高速高靈敏度的Flash 4.0 sCMOS相機(jī)，作者在文章中專門提到： "… Our data demonstrate that the high acquisition speed of SPIM with modern sCMOS cameras (400 fps for 512 × 512 pixels) is key for optimal 3D reconstructions of the beating heart."

??下面這個(gè)應(yīng)用實(shí)例則是希望通過Di-4-ANEPPS這個(gè)染料對iPS心肌細(xì)胞的膜動作電位進(jìn)行成像。Di-4-ANEPPS這種熒光染料通過藍(lán)光(~48 8nm)激發(fā)，其發(fā)射波長卻會根據(jù)膜電位而有所變化，通過計(jì)算細(xì)胞不同區(qū)域內(nèi)525 nm/630 nm的比值就可以得到此區(qū)域內(nèi)膜電位的變化。這種成像方法相相對膜片鉗等電生理方法而言，可以得到細(xì)胞任意位置的膜電位變化，空間分辨率更高。而W-View GEMINI雙色分光附件以及高速高靈敏度的Flash 4.0 sCMOS相機(jī)的應(yīng)用也保證了其極高的時(shí)間分辨率(每秒100個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn))，使得我們可以對細(xì)胞任意位置的動作電位進(jìn)行時(shí)間空間都非常精確的測量。

????應(yīng)用之明場-熒光同步成像

??在顯微成像中，有時(shí)會希望能夠?qū)晒夂兔鲌鲞M(jìn)行完全同步的成像。例如在下面所示的例子中，斑馬魚尾部血管中的部分血細(xì)胞被標(biāo)記了綠色的熒光。為了區(qū)分清楚同時(shí)處于高速運(yùn)動狀態(tài)的被標(biāo)記細(xì)胞和普通細(xì)胞，以及看清楚其具體的行為，我們不僅需要高速采像，而且需要完全同步地拍攝到樣品熒光和明場的圖像;否則對于這樣高速運(yùn)動的樣品，先拍一張明場再拍一張熒光就很難做到細(xì)胞的一一對應(yīng)。而為了達(dá)到這些要求，我們采用紅光進(jìn)行明場的拍攝，這樣W-View GEMINI雙色分光器就可以將紅色的明場信號及綠色的熒光信號分光并成像到相機(jī)芯片的兩邊(參見下右的光路示意圖)，實(shí)現(xiàn)完全同步地?zé)晒夂兔鲌龀上?。?shí)驗(yàn)中濱松Flash 4.0 LT sCMOS相機(jī)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)400幀/秒的高速拍攝，而且其高靈敏度保證了對應(yīng)的2.5 ms曝光時(shí)間下熒光圖片的清晰( "詳細(xì)解說視頻" )

??而在下面這個(gè)例子中，研究者同步拍攝監(jiān)測了心肌細(xì)胞波動時(shí)的鈣離子濃度變化以及細(xì)胞收縮的情況。藍(lán)光激發(fā)發(fā)綠色熒光的Fluo-8被用于鈣離子濃度的監(jiān)測，而明場的相差(phase contrast)成像則是采用了600-680 nm的紅光。通過對單個(gè)細(xì)胞中鈣離子濃度和相差圖像的分析，可以看出鈣離子的濃度上升是稍稍領(lǐng)先于心肌細(xì)胞的收縮的。

??參數(shù)

審核編輯 黃宇