用于結(jié)直腸癌早期診斷的的外泌體檢測平臺

外泌體因其具有豐富的生物信息和高穩(wěn)定性，被認為是結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）診斷的新型生物標志物。然而，對于具有特異性表面受體的外泌體的準確檢測限制了其臨床應用。

近期，山東大學齊魯醫(yī)學院杜魯濤教授課題組在Small期刊上發(fā)表了題為“Construction of Exosome SORL1 Detection Platform Based on 3D Porous Microfluidic Chip and its Application in Early Diagnosis of Colorectal Cancer”的文章，構(gòu)建了3D多孔海綿微流控芯片上的外泌體富集平臺，該芯片的外泌體捕獲效率約為90%。此外，研究人員通過深度質(zhì)譜分析后進行多級表達篩選，揭示了CRC特異性外泌體膜蛋白（SORL1），并進一步設計了一種基于特定量子點標記的SORL1檢測方法，通過對64張熒光圖像進行特征提取，建立了集成分類系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)的曲線下面積（AUC）為0.99，明顯高于使用傳統(tǒng)生物標志物。上述系統(tǒng)在處理早期、進展期和CEA陰性結(jié)直腸癌患者時表現(xiàn)出類似的診斷性能。

為克服近表面流體動力學阻力，提高表面體積比，并增強微通道內(nèi)的傳質(zhì)，研究人員設計并構(gòu)建了新型多孔海綿芯片。該平臺由簡單制備而成的聚二甲基硅氧烷（PDMS）預聚體、固化劑、研磨NaCl微粒生成硬模板。通過調(diào)節(jié)模板與PDMS預聚體的混合比例和NaCl粉末的直徑，從而改變微流控芯片中PDMS海綿的多孔結(jié)構(gòu)（圖1A）。針對CRC患者，通過質(zhì)譜蛋白組學分析篩選到一個新的外泌體表面蛋白SORL1，并通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting，WB）和流式細胞術(shù)檢測進行驗證。接著，利用構(gòu)建的多孔海綿芯片和硅量子點（Si-QD）共軛捕獲抗體檢測CRC患者血清中外泌體SORL1的表達（圖1B）。最后，將獲得的熒光圖像使用基于AI的集成分類系統(tǒng)進行分析和量化，該系統(tǒng)可以高效準確地區(qū)分CRC患者和非CRC人群（圖1C）。

圖1 3D多孔海綿芯片的構(gòu)建及外泌體的分析

為了實現(xiàn)對CRC來源外泌體的高靈敏度檢測，研究人員首先使用球磨機研磨NaCl顆粒形成均勻的粉末。如圖2A所示，未處理的NaCl平均粒徑在粉碎后由176μm ± 35μm減小到3.35μm ± 0.87 μm，說明粉碎方法可以有效降低NaCl平均粒徑。多孔海綿芯片的實物圖和渲染圖如圖2B所示。芯片（左上面板）中心的白色區(qū)域是多孔PDMS海綿結(jié)構(gòu)，在相鄰的多孔結(jié)構(gòu)之間具有凹槽，以破壞層流。多孔PDMS結(jié)構(gòu)的表面和斷面掃描電子顯微鏡（SEM）圖像也顯示了具有相互連通的孔洞的多孔形貌。該研究利用PDMS可以非特異性地大量吸附蛋白質(zhì)的原理，將抗體高效地固定在芯片內(nèi)部的多孔PDMS結(jié)構(gòu)上。使用CD9抗體進行固定以捕獲外泌體，并選擇兩種抗體固定方法：分別在37℃孵育2 h和4℃孵育過夜。為了探究最佳的抗體固定方法，使用熒光顯微鏡對芯片進行熒光成像。以FITC二抗的熒光強度用來評價一抗固定效果。對于BSA和PBS孵育的兩組芯片，非特異性熒光吸附較弱，兩組芯片的熒光強度均遠低于CD9抗體孵育組（圖2C）。37℃孵育2 h后的抗體固定量是4℃孵育過夜的4.797倍，表明37°C孵育2 h是抗體固定的最佳條件。

隨后，研究人員通過超速離心法從SW1116細胞的培養(yǎng)上清中獲得純化的結(jié)腸癌外泌體。采用透射電子顯微鏡（TEM）、Western blotting和納米顆粒跟蹤分析（NTA）3種應用最廣泛的外泌體分析方法對分離的外泌體進行性質(zhì)表征。圖2D顯示了標準的外泌體形態(tài)，包括圓形或橢球形。采用NTA分析外泌體濃度和平均直徑。粒徑為103.1 nm，峰濃度為7.7 × 10?，與文獻報道一致（圖2E）。利用Western blotting鑒定出癌細胞和外泌體膜靶蛋白CD9、CD63和TSG101（圖2F）。隨著樣品的持續(xù)進樣，芯片的實時熒光捕獲效率逐漸降低。20 μL時熒光強度（ΔFL）最高為97.45% ± 2.29%，100 μL時ΔFL最低為74.45% ± 8.8%，ΔFL的平均熒光效率為85.25% ± 5.51%（圖2G）。多孔海綿芯片的NTA捕獲效率為80.12% ± 3.45%，而超速離心僅為15.5% ± 1.70%（圖2H）。熒光圖像進一步揭示了外泌體具有較高的捕獲效率（圖2I）。NTA和熒光分析得到的結(jié)果一致，證明了多孔海綿芯片分離和捕獲外泌體的高效性。

圖2 外泌體和3D多孔海綿芯片的表征 接著，研究人員初步選取8例健康人（HCs）和8例CRC患者的血清樣本，對收集到的血清外泌體進行無標記蛋白質(zhì)組學分析。與HCs相比，CRC患者中共鑒定出367個差異表達蛋白，其中上調(diào)蛋白136個，下調(diào)蛋白231個，包括FTH1、RPS8、CFH、PIGR、PSMA3和CCT8（圖3A）。在CRC和正常樣本中分別有25個蛋白和62個蛋白特異性表達。

為了驗證篩選出的分子是否位于外泌體膜表面，研究人員使用SW620細胞來源的外泌體進行流式檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，CRC樣本中SORL1和PSMA3的熒光強度較高，而CCT8、PIGR和CAT表達在基礎水平，表明SORL1和PSMA3定位于外泌體膜表面（圖3B）。接下來，通過Western blotting分析測定細胞上清和血清樣本外泌體中SORL1和PSMA3蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，在CRC細胞培養(yǎng)上清中可以穩(wěn)定檢測到SORL1和PSMA3（圖3C）。此外，與HCs相比，SORL1在CRC患者血清中表現(xiàn)出更高的表達，而PSMA3的表達無統(tǒng)計學意義（圖3D）。通過對27例CRC患者和27例HCs血清中外泌體SORL1的定量檢測，研究人員證實了CRC患者血清中SORL1的水平顯著高于HCs，表明外泌體SORL1在區(qū)分結(jié)直腸癌患者和非結(jié)直腸癌人群中的潛在診斷價值（圖3E）。

圖3 無標記定量蛋白質(zhì)組學對外泌體蛋白的分析

為了利用3D微流控芯片有效定量SORL1的表達，研究人員制備了Si-QD偶聯(lián)的SORL1抗體（Si-QD-SORL1）。TEM結(jié)果表明Si-QD和SORL1抗體融合，成功合成了Si-QD-SORL1復合物（圖4A）。UV-vis光譜掃描結(jié)果證明Si-QD在357 nm處有明顯的吸收峰，加入SORL1抗體形成Si-QD-SORL1復合物后，吸收峰明顯減弱（圖4B）。將3D多孔芯片與Si-QD-SORL1結(jié)合后，在室溫下放置10min、30min、50min、70min和90 min后評估熒光強度穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在所考察的時間范圍內(nèi)，熒光強度無明顯變化，表明Si-QD-SORL1復合物具有較高的穩(wěn)定性（圖4C）。為了確認注入芯片的樣品熒光強度是飽和且穩(wěn)定的，研究人員測試了多孔芯片組合的最佳Si-QD-SORL1的體積和濃度。根據(jù)圖4D所示，芯片從左到右有3個捕獲區(qū)域，捕獲區(qū)域的熒光分布均勻穩(wěn)定，能夠準確反映外泌體SORL1的整體表達情況（圖4E）。此外，研究人員對外泌體進行PKH67-green染色，觀察到Si-QD-SORL1（紅色信號）與CD9結(jié)合的外泌體共定位（圖4F）。這證實了熒光信號是通過兩步免疫反應檢測通道中的量子點產(chǎn)生的。

圖4 Si-QD-SORL1及外泌體檢測系統(tǒng)的表征

為了更好地理解和準確判讀熒光成像結(jié)果，研究人員通過激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）高分辨率熒光篩選，開發(fā)、訓練和優(yōu)化了圖像檢測模塊。首先，為了提高集成系統(tǒng)的解譯效果，系統(tǒng)將影像劃分為64個圖斑，并基于亮度、方差和均值3個特征獲取信息（圖5A）。接下來，研究人員招募了一個獨立、匹配和隨機分配的人群隊列，包括106名CRC和100名HC，并將其分為訓練和測試階段。在訓練階段采用隨機森林分析建立臨床判別模型，在測試階段采用交叉驗證。為了驗證外泌體SORL1區(qū)分CRC患者和HC的能力，研究人員隨機選取了27例CRC患者和25例HC患者作為訓練集，其余樣本在測試集中進行表征。結(jié)果顯示，與健康人相比，SORL1在CRC患者樣本中顯著上調(diào)（圖5B）。91.14%的CRC患者（79人中有72人）和100%的HCs被正確診斷（圖5C），同時具有達到0.99的工作特征曲線下面積（AUC）（圖5D）。同時，研究人員也考察了外泌體SORL1在其他幾個特定人群。他們檢測了該方法對80例早期CRC患者（期和Ⅱ期）的診斷性能。結(jié)果表明，早期CRC患者和HCs的樣本可以被有效區(qū)分（圖5E），其診斷靈敏度達到97.50%，AUC為0.99（圖5F、5G），具有較好的診斷準確性。

目前對于50歲以下的低中危人群的CRC篩查尚未達成（young CRC patients，yCRC)。在yCRC人群中，該方法的結(jié)果清楚地揭示了外泌體SORL1可以區(qū)分yCRC患者和HCs，診斷敏感性和特異性均達到100%（圖5H）。但對于yCRC的診斷結(jié)果可能需要進一步的研究，因為該研究僅有12例yCRC患者。在該研究中，研究人員同時增加了35個腫瘤樣本，包括12個胃癌（gastric cancer，GC）、12個肺癌（lung cancer，LC）和11個胰腺癌（pancreatic cancer，PANC）樣本，以驗證SORL1是否在CRC中特異性表達。利用上述35例腫瘤樣本，隨機選取35例健康對照者，共形成70例樣本，構(gòu)成非CRC對照組。結(jié)果表明，SORL1可以從非CRC癌癥患者中診斷CRC患者，靈敏度和特異度分別達到93.67%和96.15%（圖5I）。

圖5 基于AI分類的外泌體SORL1的診斷性能

單一標志物CEA檢測常用于血液學CRC篩查。結(jié)果顯示，CEA的診斷敏感性為47.17%，在106例CRC患者中僅有50例被正確診斷（圖6A、6B）。而超過一半的早期CRC病例CEA陰性，表明其在早期CRC患者中的診斷能力較差。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在56例CEA陰性患者中，52例患者被本研究提出的方法正確診斷（圖6C），診斷AUC為0.99（圖6D）。

該研究的方法的潛在應用在兩個病例中得到了肯定，這兩個病例通過該研究發(fā)展的方法得以正確診斷，而其被CEA、上皮細胞粘附分子（EpCAM）和結(jié)腸鏡檢查遺漏了（圖6E）。一號病人因排便不規(guī)律而入院。結(jié)腸鏡檢查顯示無明顯惡性特征，診斷為良性息肉（圖6F）。然而，術(shù)后病理報告證實了高級別上皮內(nèi)瘤變（圖6F）。第二例患者也出現(xiàn)了類似的情況，該患者使用基于SORL1的微流控芯片方法診斷為CRC，病理證實為原位I期CRC，但CEA和EpCAM未發(fā)現(xiàn)（圖6E、6F）。這些結(jié)果有力地證明了外泌體SORL1在檢測微小腫瘤和早期CRC方面的優(yōu)勢。

圖6 通過SORL1等方法診斷CRC

綜上所述，該研究通過在微流控芯片上構(gòu)建3D多孔海綿結(jié)構(gòu)，將其與新發(fā)現(xiàn)的CRC分子標記物SORL1、量子點檢測方法和機器學習智能分析系統(tǒng)相結(jié)合，建立了一種新型特異高效的檢測技術(shù)平臺。該平臺能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體在芯片表面的高度富集，便于快速捕獲和定量檢測。新建立的智能圖像判別系統(tǒng)能夠高效地實現(xiàn)CRC的早期診斷，為CRC的早期檢測提供了新方法和新途徑。

審核編輯：劉清