基于自供電酶聯(lián)微針的神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管設(shè)計(jì)

對于外周神經(jīng)缺損，尤其是較大外周神經(jīng)缺損，由于其再生能力有限，臨床實(shí)踐中患者恢復(fù)效果較差。近日，來自蘭州大學(xué)的范增杰教授團(tuán)隊(duì)利用自供電微針貼片制成的可植入神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管，進(jìn)行了坐骨神經(jīng)修復(fù)的相關(guān)研究。研究成果以“Implantable Nerve Conduit Made of a Self-Powered Microneedle Patch for Sciatic Nerve Repair”為題于發(fā)表在AHM期刊上。

該研究設(shè)計(jì)并制造了一種先進(jìn)的自供電酶聯(lián)微針（MN）神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管（NGCs）。這種創(chuàng)新型導(dǎo)管由陽極和陰極微針陣列組成，其中分別含有封裝在ZIF-8納米顆粒中的葡萄糖氧化酶（Gox）和辣根過氧化物酶（HRP）。通過級聯(lián)反應(yīng)，基于微針的神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管產(chǎn)生微電流，刺激坐骨神經(jīng)支配的肌肉、血管和神經(jīng)纖維再生，最終加速坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)。該自供電微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管將徹底改變坐骨神經(jīng)損傷的傳統(tǒng)治療方法，并在神經(jīng)組織修復(fù)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

圖1 促進(jìn)坐骨神經(jīng)修復(fù)的自供電級聯(lián)微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管示意圖

該研究利用聚多巴胺（DA）修飾的聚吡咯（PPy）/聚乙烯醇（PVA）（DPP）水凝膠組成導(dǎo)電基底，開發(fā)了一種自供電和自組裝的微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管（MNGCs）。這些微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管一半裝有含葡萄糖氧化酶（Gox）的ZIF-8，一半裝有含辣根過氧化物酶（HRP）的ZIF-8，分別形成陽極和陰極微針陣列。兩個(gè)陣列之間的酶聯(lián)作用通過消耗血糖產(chǎn)生微電流，促進(jìn)損傷坐骨神經(jīng)的修復(fù)，恢復(fù)坐骨神經(jīng)損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)和感覺。結(jié)果表明，DPP導(dǎo)電基底具有良好導(dǎo)電性，能將酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的電子介導(dǎo)出來，形成完整電流通路。微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管具有高柔韌性，其微米大小的尖端可插入神經(jīng)殘端周圍組織，固定神經(jīng)并防止在運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)生移位。此外，微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管不僅能為神經(jīng)修復(fù)提供物理支持，引導(dǎo)軸突生長，還能通過自身微電流調(diào)節(jié)細(xì)胞，引導(dǎo)神經(jīng)元再生，達(dá)到周圍神經(jīng)損傷治療效果。

DA-PPy、ZIF-8和ZG/ZH納米粒子表征

研究人員為了克服PPy在水中分散性差的問題，使用DA改性以改善PPy在水中的分散性。利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察所制備的DA-PPy復(fù)合材料表面形態(tài)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)DA改性后，PPy的形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，從成團(tuán)的團(tuán)塊變成均勻的短纖維（圖2a）。傅立葉變換紅外光譜（FTIR）分析進(jìn)一步證實(shí)DA-PPy成功合成，在DA-PPy復(fù)合材料中觀察到DA的特征帶出現(xiàn)在2930/cm處。接著使用透射電鏡（TEM）對合成的ZIF-8和負(fù)載Gox以及HRP的ZIF-8納米粒子的形態(tài)進(jìn)行表征?？梢钥闯鯶IF-8具有菱形十二面體的幾何形狀，尺寸分布均勻。然而，由于添加了Gox和HRP，ZIF-8納米晶體結(jié)構(gòu)變成表面粗糙的球形顆粒。該研究采用兩步法制備用于神經(jīng)修復(fù)的自供電微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管，微針貼片由11 ×11的有序錐形針陣列組成，整齊排列在微針基質(zhì)上。微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管兩部分中的ZG和ZH納米粒子可感知局部體液中的血糖，并迅速促進(jìn)酶級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，從而產(chǎn)生微電流。微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管陽極陣列中的ZG納米顆粒所含的Gox與體液中的血糖迅速反應(yīng)，生成葡萄糖酸和過氧化氫。含有HRP的陰極微針陣列會與生成的過氧化氫進(jìn)一步反應(yīng)，生成氧和水，釋放出陽極陣列中的電子，使電子流形成回路，最終產(chǎn)生微電流。這些微電流可能有利于周圍神經(jīng)損傷的快速修復(fù)。

圖2 材料表面和微針形態(tài)分析

細(xì)胞生物相容性和遷移

通過活死細(xì)胞染色評估微針貼片的生物相容性。結(jié)果表明，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，與不同微針貼片共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞大部分都是綠色熒光而非紅色熒光染色，表明具有導(dǎo)電性的微針貼片具有良好的生物相容性。使用MTT法檢測了微針貼片對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，與不同微針貼片共培養(yǎng)的細(xì)胞存活率均超過80%，進(jìn)一步驗(yàn)證了微針貼片對細(xì)胞無毒性作用。接著利用劃痕實(shí)驗(yàn)研究制備的微針貼片對細(xì)胞遷移的影響。與對照組和其他實(shí)驗(yàn)組相比，自供電ZGH-MN組向劃痕中心區(qū)域的線性遷移距離更長，說明微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管產(chǎn)生的生理電流能促進(jìn)細(xì)胞遷移，加快損傷坐骨神經(jīng)的修復(fù)。這些結(jié)果證明了微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管在神經(jīng)修復(fù)應(yīng)用中的潛力。

圖3 微針貼片的生物相容性和劃痕實(shí)驗(yàn)

組織學(xué)評估

為評估不同組的神經(jīng)再生效果，在術(shù)后6周和12周對大鼠的坐骨神經(jīng)進(jìn)行H&E染色。第6周時(shí)，與其他組相比，Blank-MN組和ZIF-MN組的再生神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)稀疏，而ZGH-MN組和自體移植組的修復(fù)效果最好。第12周時(shí)，愈合組織具有更多的新生神經(jīng)組織，尤其是在ZGH-MN組，再生神經(jīng)纖維和細(xì)胞明顯增多，僅次于自體移植組。各組再生神經(jīng)組織之間也都出現(xiàn)新生血管。

圖4 第6周和第12周H&E染色圖像

免疫熒光染色評估

雪旺細(xì)胞（SCs）是周圍神經(jīng)的初級細(xì)胞之一，其外表面有一層基底膜，可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)受損神經(jīng)元生存及其軸突再生。使用NF200（神經(jīng)絲）和S-100（雪旺細(xì)胞）免疫熒光分析來評估再生神經(jīng)中軸突和SC的生長情況。所有組都有新軸突生長和由SC組成的髓鞘形成。自體移植組兩種標(biāo)記的陽性面積比例最高。在微針處理組中，ZGH-MN組兩種標(biāo)記物的表達(dá)水平明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，表明自供電微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管可通過促進(jìn)SCs生長和髓鞘形成來促進(jìn)軸突再生?？傊怨╇娒嘎?lián)微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管在促進(jìn)軸突再生、髓鞘化以及肌肉和神經(jīng)再生方面具有顯著功效。微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管機(jī)械特性強(qiáng)同時(shí)自粘附特性，可防止神經(jīng)導(dǎo)管脫落，避免手術(shù)縫合造成二次神經(jīng)損傷。陽極微針陣列中ZG和陰極微針陣列中ZH之間的氧化還原反應(yīng)可與體液中反應(yīng)形成生理微電流。微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管的良好導(dǎo)電性和生物可塑性也有助于提高其有效性。最后，微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管產(chǎn)生的生理微電流刺激可激活和鍛煉肌肉纖維，防止神經(jīng)損傷后發(fā)生萎縮。

圖5 神經(jīng)元再生和SCs生長情況

綜上所述，該研究通過將微針與酶級聯(lián)反應(yīng)相結(jié)合，成功開發(fā)出一種新型自供電級聯(lián)微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管。研究人員對微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管形態(tài)、導(dǎo)電性、機(jī)械性能和生物兼容性進(jìn)行全面評估。結(jié)果表明，微針針尖保持完整形狀，可以將微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管固定在損傷神經(jīng)末端。均勻分布在針尖上的ZG和ZH納米顆粒與體液接觸后，通過酶級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生電生理信號，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。總之，自供電酶級聯(lián)微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管具有產(chǎn)生電生理信號同時(shí)促進(jìn)軸突再生、髓鞘化、肌肉和神經(jīng)生長的能力。自供電酶級聯(lián)微針神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管可以作為神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域一種有前途的解決方案。

審核編輯：劉清