氨基酸低頻拉曼光譜發(fā)現(xiàn)第二個(gè)指紋區(qū)域

文摘

Princeton Instruments SCT 320 IsoPlane Schmidt-Czerny-Turner (SCT) 光譜儀是一種新穎的無像散光譜儀設(shè)計(jì)，與傳統(tǒng)的 Czerny-Turner (CT) 光譜儀相比，其拉曼光譜具有更好的分辨率和信噪比。單級(jí) SCT 攝譜儀已與新型低頻拉曼光譜模塊連接，該模塊使用體積相位全息光柵作為瑞利線濾波器。該系統(tǒng)已用于測(cè)量幾種結(jié)晶氨基酸的低頻拉曼光譜。L-胱氨酸的光譜顯示峰距離瑞利線接近10 cm -1是可測(cè)量的。光譜顯示出復(fù)雜的峰模式，可用于輕松區(qū)分不同的酸，從而形成所謂的“第二指紋區(qū)域”。雖然這里描述的系統(tǒng)對(duì)于低頻拉曼工作有用，但對(duì)于檢查樣品的高頻模式也很有用。

介紹

車爾尼-特納 (CT) 光譜儀幾十年來一直用于測(cè)量樣品的拉曼光譜。1,2 CT 攝譜儀設(shè)計(jì)中固有的光學(xué)像差，包括像散、慧差和球面像差。3 當(dāng)使用鏡子將光源聚焦到離軸時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)像散，從而產(chǎn)生扭曲的圖像和展寬的光譜峰值，從而降低光譜分辨率。當(dāng)使用鏡子對(duì)離軸源進(jìn)行成像時(shí)，會(huì)發(fā)生慧差，并產(chǎn)生具有彗星狀尾巴的圖像和具有不對(duì)稱加寬峰值的光譜。球面像差是由于使用球面鏡聚焦圖像而引起的，導(dǎo)致圖像對(duì)稱模糊和光譜展寬。這些光學(xué)像差是物理定律的結(jié)果，并且存在于 CT 光譜儀中，無論其制造商如何。

CT 設(shè)計(jì)中固有的像散、慧差和球面像差的最終結(jié)果是拉曼峰質(zhì)量較差。如圖1所示，用CT光譜儀測(cè)量的環(huán)己烷802 cm -1拉曼位移峰具有不對(duì)稱線形，變寬，因此降低了光譜分辨率，并且峰很短，從而降低了信噪比(SNR)。

針對(duì)CT 攝譜儀的問題，Princeton Instruments 開發(fā)了 Schmidt-Czerny-Turner (SCT) 攝譜儀，或IsoPlane? SCT 320 攝譜儀。與 CT 設(shè)計(jì)相比，SCT 光譜儀在整個(gè)焦平面上的所有波長(zhǎng)上都具有零像散，并且彗差和球面像差水平降低。圖1顯示了用CT和SCT光譜儀測(cè)量的環(huán)己烷802cm -1拉曼位移峰的比較。SCT 峰具有對(duì)稱形狀，比 CT 峰窄，因此具有更好的光譜分辨率，并且更高，從而產(chǎn)生更好的 SNR。通過減少光學(xué)像差，SCT 光譜儀提供的拉曼光譜比 CT 光譜儀具有更好的分辨率和信噪比。

圖 1.使用 Czerny-Turner(紅色)和 Schmidt-Czerny-Turner(藍(lán)色)IsoPlane 光譜儀測(cè)量環(huán)己烷的802 cm -1拉曼位移帶。這些光譜是在焦平面的中心測(cè)量的。(532 nm 激發(fā)，玻璃管中的樣品，180° 反向散射，背照式 CCD，1200 g/mm 光柵。)

低頻 (10–200 cm -1 ) 拉曼譜帶提供固體中晶格模式的信息，可用于區(qū)分活性藥物成分多晶型物，4提供有關(guān)無機(jī)和有機(jī)金屬化合物中金屬離子的信息，并用于確定碳納米管的直徑來自徑向呼吸模式的峰值位置。

傳統(tǒng)上，需要三重單色儀來抑制瑞利線，從而允許測(cè)量低頻拉曼光譜。Ondax 的新型低頻拉曼分析系統(tǒng)XLF-CLM 使用體相位全息光柵作為超窄陷波瑞利線濾波器。該系統(tǒng)拒絕足夠多的彈性散射光子，從而僅使用單級(jí)攝譜儀就可以觀察到距離瑞利線近10 cm -1的譜帶。這使得低頻拉曼系統(tǒng)重量輕、易于使用且價(jià)格合理。

該系統(tǒng)的局限性在于它只能在一種激發(fā)波長(zhǎng)下工作，在本例中為 785 nm。此外，由于使用了體相位全息光柵，該系統(tǒng)無法在紫外線下工作。因此，三重單色儀對(duì)于使用多激光激發(fā)線、擁有可調(diào)諧激光系統(tǒng)或在紫外線下工作的研究人員來說仍然有用。而且，由于三重單色儀包含三個(gè)光譜儀，因此它可以比本文描述的系統(tǒng)產(chǎn)生更高分辨率的光譜，而本文描述的系統(tǒng)的分辨率因僅使用一個(gè)光譜儀而受到限制。

XLF-CLM 低頻拉曼前端已與Schmidt-Czerny-Turner 攝譜儀連接，以產(chǎn)生高質(zhì)量的低頻拉曼光譜。已經(jīng)用該系統(tǒng)測(cè)量了幾種氨基酸的低頻拉曼光譜。令人驚訝的是，觀察到了獨(dú)特而復(fù)雜的峰模式，使這些光譜的 10-200 cm -1區(qū)域成為“第二指紋區(qū)域”。該波數(shù)區(qū)域可能對(duì)于區(qū)分具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物非常有用。

實(shí)驗(yàn)

分析的氨基酸為胱氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。氨基酸以結(jié)晶固體形式購(gòu)自 Sigma-Aldrich(密蘇里州圣路易斯)并按原樣使用。在所有情況下都對(duì)L 異構(gòu)體 進(jìn)行了分析。樣品裝在帶有旋蓋的玻璃瓶中。小瓶具有可重復(fù)但較小的熒光光譜，在數(shù)據(jù)處理之前從樣品光譜中減去該光譜。

Ondax(加利福尼亞州蒙羅維亞)的XLF-CLM 低頻拉曼分析系統(tǒng)用于測(cè)量低頻拉曼光譜。該模塊包含樣品架、聚焦物鏡、785 nm Ondax SureLock? 激光器、放大自發(fā)發(fā)射濾光片、中性密度濾光片以及光密度 >8 的 Ondax SureBlock? 專有固體玻璃體全息光柵。以 180° 反向散射模式收集光。使用~50 mW 的激光功率。來自 Ondax 系統(tǒng)的光通過單芯 25 μm 直徑光纖耦合到光譜儀。

使用的攝譜儀是Princeton Instruments (Trenton, NJ) IsoPlane SCT 320 Schmidt-Czerny-Turner 攝譜儀。該光譜儀的焦距為 320 mm，配備 600 槽/mm 光柵，閃耀波長(zhǎng)為 500 nm。IntelliCal? 波長(zhǎng)校準(zhǔn)系統(tǒng)的波長(zhǎng)軸。波長(zhǎng)校準(zhǔn)的精度為0.01 nm。通過獲取硫的低頻拉曼光譜并將其與文獻(xiàn)進(jìn)行比較來檢查校準(zhǔn)。8 20 至 220 cm -1之間的 8 個(gè)硫峰的測(cè)量值和文獻(xiàn)峰位置與標(biāo)準(zhǔn)偏差 0.57 cm -1一致。L-胱氨酸光譜中測(cè)量的五個(gè)峰與文獻(xiàn)值4的比較產(chǎn)生0.29cm -1的標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)量了斯托克斯和反斯托克斯光譜。

使用的相機(jī)是帶有eXcelon?的 Princeton Instruments PIXIS:400BRX 背照式深度耗盡傳感器。CCD 冷卻至-70°C。在芯片中心定義了 15 行高的感興趣區(qū)域，并且該區(qū)域中的所有行都被垂直分組。發(fā)現(xiàn)該區(qū)域之外的傳感器行包含可以忽略不計(jì)的信號(hào)計(jì)數(shù)。使用Princeton Instruments LightField? 軟件 v4.5控制設(shè)備并收集數(shù)據(jù)。使用 Thermo Fisher Scientific(馬薩諸塞州沃爾瑟姆)的 GRAMS v9.1 軟件處理和顯示數(shù)據(jù)。

結(jié)果與討論

拉曼光譜經(jīng)常以4000 至 200 cm -1的位移進(jìn)行測(cè)量。靠近瑞利線的峰很難看到，因?yàn)樵摲宓某叽绾蛯挾榷己艽?。三重單色?可以抑制大多數(shù)瑞利散射光子并允許看到低頻拉曼位移。然而，這些系統(tǒng)龐大且昂貴。因此，10 至 200 cm -1的拉曼位移不像高頻拉曼峰那樣被常規(guī)測(cè)量。

L-胱氨酸的光譜可以很好地測(cè)試?yán)到y(tǒng)接近瑞利線的能力，因?yàn)樗?5 和 10 cm -1處有已知的峰。4,6圖 2 顯示了使用Ondax 低頻拉曼前端和Princeton Instruments IsoPlane 攝譜儀測(cè)量的接近瑞利線的胱氨酸光譜。請(qǐng)注意，在 9.7 cm -1處有斯托克斯峰和反斯托克斯峰，證實(shí)該系統(tǒng)可以距離瑞利線近至 10 cm -1 。圖 2 顯示本系統(tǒng)中的體全息光柵在抑制瑞利線方面表現(xiàn)出色，這意味著現(xiàn)在只需要單級(jí)光譜儀即可獲得低頻拉曼光譜。

圖 2. 靠近瑞利線的胱氨酸拉曼光譜。注意 9.7 cm -1處的斯托克斯峰和反斯托克斯峰。

雖然該系統(tǒng)提供低頻拉曼光譜，但使用粗光柵和調(diào)整中心波長(zhǎng)可以同時(shí)觀察到低頻和高頻峰，如圖3所示，它顯示了來自15～800cm -1。

圖3.胱氨酸的拉曼光譜，表明本系統(tǒng)可以同時(shí)獲取低頻和高頻光譜。

在拉曼位移大于 200 cm -1時(shí)采樣的振動(dòng)通常涉及單個(gè)官能團(tuán)或單個(gè)分子，這些振動(dòng)最好表征為內(nèi)部或分子內(nèi)模式。低于 200 cm -1 ，可以看到涉及分子群的模式。這些振動(dòng)常常涉及一個(gè)或多個(gè)分子的受挫平移或旋轉(zhuǎn)(振動(dòng))。這些類型的振動(dòng)被稱為外部或分子間模式8，在固體晶格模式的情況下，振動(dòng)被稱為聲子，并且可能涉及晶胞的運(yùn)動(dòng)。有機(jī)晶體的晶格模式通常低于 130 cm-1。8具有芳香環(huán)的分子通常在該區(qū)域具有一系列特征，并且通常具有強(qiáng)烈的低頻拉曼峰。

圖 4. 使用本文所述的低頻拉曼散射模塊和 Schmidt-Czerny-Turner 攝譜儀測(cè)量的結(jié)晶氨基酸胱氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的低頻拉曼光譜

請(qǐng)注意，圖 4 中光譜中最繁忙的區(qū)域位于50 至 150 cm -1之間。對(duì)于這一觀察結(jié)果的一種可能的解釋是，在該區(qū)域中，外部模式和內(nèi)部模式的能量重疊，導(dǎo)致振動(dòng)相互作用，例如費(fèi)米共振，從而在光譜中添加峰值，從而使它們的外觀變得復(fù)雜。50 cm -1以下的區(qū)域并不復(fù)雜，因?yàn)橐苍S只有晶格模式落在如此低的能量下。150-200 cm -1區(qū)域相對(duì)安靜，可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)內(nèi)部模式都落在這個(gè)區(qū)域，并且許多氨基酸在如此低的能量下可能不會(huì)振動(dòng)。即將出版的出版物中包含對(duì)圖 4 中每個(gè)光譜及其與已知文獻(xiàn)值的比較的詳細(xì)討論。

結(jié)論

施密特-車爾尼-特納攝譜儀與低頻拉曼散射模塊配對(duì)，該模塊包含激光器、樣品架、放大受激發(fā)射濾波器和體積相位全息光柵，以濾除瑞利線。該系統(tǒng)用于研究幾種結(jié)晶氨基酸的低頻拉曼散射光譜。L-胱氨酸的光譜在10 cm -1處有一個(gè)由該系統(tǒng)觀察到的已知峰，這表明它能夠看到距離瑞利線接近10 cm -1的峰。10 至 200 cm -1之間的氨基酸光譜顯示出每種化合物所特有的復(fù)雜的強(qiáng)烈峰模式，這些峰可能來自于晶格模式、低頻內(nèi)部模式及其相互作用。該區(qū)域的細(xì)節(jié)水平足以將其稱為“第二指紋區(qū)域”。

審核編輯 黃宇