通過顯微光譜對單線態(tài)氧進行實時成像

介紹

氧分子是維持生命以及生命滅絕和材料破壞機制中最重要的分子之一。幾十年來，研究人員一直對分子氧的最低激發(fā)態(tài)單線態(tài)氧 (1O2)的物理和化學性質(zhì)很感興趣。特別是，單線態(tài)氧具有獨特的反應性，可以導致聚合物降解或生物細胞死亡。它作為細胞死亡中間體的作用被癌癥光動力療法 (PDT)所利用，該技術(shù)將光用作醫(yī)療工具。

PDT是將光敏劑(PS)摻入異常組織，然后用可見光照射，使其通過II型光化學途徑將能量傳遞給基態(tài)氧，產(chǎn)生單線態(tài)氧(可以通過其微弱的1270 nm直接檢測到)排放)。 由于對闡明單線態(tài)氧在亞細胞水平上的生化作用的特殊興趣，已經(jīng)提出了幾種高空間分辨率方法來使用單個光電倍增管( PMT)、線性InGaAs探測器陣列、或二維InGaAs探測器。

在本應用說明中，查爾斯大學(捷克共和國布拉格)的 Marek Scholz 博士對使用 Princeton Instruments 的NIRvana:640 InGaAs 相機的新型顯微光譜裝置進行了評估。Scholz 博士報告說，新型 NIRvana ?相機的二維 InGaAs 陣列使他本人和 Jan Hála 教授領(lǐng)導的光學光譜小組的其他成員能夠解決1O2磷光與NIR 擴展的潛在光譜重疊問題。 PS 的發(fā)光，從而首次提供了區(qū)分和分離它們的有效手段。

實驗裝置

該實驗裝置利用兩個檢測通道(VIS和NIR)對單線態(tài)氧和光敏劑的非常弱的近紅外磷光以及光敏劑的可見熒光同時進行實時成像。這種創(chuàng)新裝置(見圖 1)能夠采集基于單線態(tài)氧和單個細胞光敏劑發(fā)光的光譜圖像。圖像的一個維度是空間維度，另一個維度是光譜維度，涵蓋 500 至 1700 nm 的光譜范圍。

圖 1：NIR 發(fā)光顯微光譜設置：圖的下部描繪了 VIS 和 NIR 路徑檢測到的光譜區(qū)域。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 經(jīng)英國皇家化學學會 (RSC) 代表歐洲光生物學會、歐洲化學協(xié)會和 RSC 許可復制。

如圖 1 所示，直接實時成像裝置圍繞奧林巴斯倒置熒光顯微鏡構(gòu)建，并使用 405 nm 恒定波長 (CW) 激光器作為激發(fā)源。激光束穿過中性密度 (ND) 濾光片，并通過 500 nm 二向色長通鏡 (DLP) 耦合到近紅外校正物鏡 (OBJ)。通過在激發(fā)路徑中插入透鏡 (L1)，樣品 (S) 上的照明點放大至約 94 μm。為了將物鏡從樣品收集的發(fā)光發(fā)射引導至 NIR 路徑進行檢測，插入了金鏡 (GM)。移除鏡子將發(fā)射引導至 VIS 路徑。

在 NIR 路徑中，信號通過NIR 長通和短通濾波器的組合(F);過濾器的組合取決于具體的實驗。然后，信號通過消色差透鏡(L2，f = 20 cm)聚焦到Princeton Instruments 的Acton SpectraPro ? 2500i 成像光譜儀的入口狹縫上。該光譜儀與同樣來自 Princeton Instruments 的NIRvana:640 InGaAs 相機耦合(見圖 2)。為了減少暗電荷，相機的近紅外敏感二維焦平面陣列 (FPA) 被冷卻至 -80°C。

圖 2：實驗裝置的 NIR 路徑包括與 SpectraPro 2500i 成像光譜儀耦合的 Princeton Instruments NIRvana:640 二維 InGaAs 探測器。照片由查爾斯大學 Marek Scholz 博士提供

2500i 光譜儀配置有用于光譜的光柵(150 g/mm，1.2 μm 閃耀)或用于成像的鏡子。為了最大限度地減少樣品光漂白，激發(fā)路徑中的快門 (SH) 由 NIRvana 相機控制，并且僅在曝光時間內(nèi)打開。在成像模式下，樣品上 0.34 x 0.34 μm 的區(qū)域被放大至 NIRvana FPA 的 20 x 20 μm 像素大小，相當于 58 倍放大倍數(shù)。1275 nm ( 1O2磷光帶)，根據(jù)瑞利準則，由衍射極限引起的空間分辨率約為 1.4 μm，由物鏡數(shù)值孔徑 0.55 確定。在光譜模式下，系統(tǒng)的光譜分辨率由光譜儀入口狹縫的寬度決定，為10 nm。

或者，在 VIS 路徑中，Princeton Instruments 的 Spec-10:400B 背照式 CCD 相機與 Acton SpectraPro 2300i 成像光譜儀耦合。最近，為了同時檢測 VIS 和 NIR 光譜區(qū)域，通過用短通二向色鏡 (DM) 替換金鏡來修改設置。原來的過濾器組也進行了修改。參見 Scholz 等人。2014 年有關(guān)實驗設置的更多詳細信息。

結(jié)果與結(jié)論

光譜成像方法的引入提供了一種強大的新工具，用于區(qū)分和分離1O2磷光與光敏劑的近紅外擴展發(fā)光的潛在光譜重疊。它可以應用于任何表現(xiàn)出近紅外發(fā)光的 PS。部分數(shù)據(jù)如下：更多內(nèi)容可參見 Scholz 等人。2014年圖 3A 中顯示的圖像是在連續(xù)照射細胞時捕獲的，該細胞與 D2O 鹽溶液中的 100 μM TMPyP 一起孵育 5 小時，激光功率為 1 W/cm2。>1250 nm 圖像(使用 850 和 1250 nm 長通濾光片的組合)是通過將一系列 10 個連續(xù)幀(每幀曝光時間為 5 秒)中的最后四幀(即總共 20 秒曝光)相加而獲得的。隨后，曝光 25 秒獲得光譜圖像。隨后拍攝明場和熒光圖像。光譜顯示1O2磷光是主要的光譜特征。對于不同的細胞，經(jīng)驗證，當使用1350 nm長通濾光片代替1250 nm長通濾光片時，>1250 nm圖像強度下降了70%以上。

圖 3：3T3 小鼠成纖維細胞與 100 μM TMPyP 在 D2 O 鹽溶液中孵育 5 小時，基于 NIR 發(fā)光的圖像和光譜，以及基于明場和 VIS 熒光的圖像?？蚣?A 和 B 代表兩個不同的樣本。綠色矩形由光譜儀的入口狹縫定義，代表收集光譜圖像的區(qū)域。光譜圖是通過光譜圖像的垂直合并獲得的。應用單位半徑的高斯模糊濾波器來平滑光譜圖像，以使弱光譜特征更容易區(qū)分。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 經(jīng)英國皇家化學學會 (RSC) 代表歐洲光生物學會、歐洲光化學協(xié)會和 RSC 許可復制。

圖 3B 中顯示的圖像是使用相同程序從孵育的不同細胞中捕獲的。通過用2.5W/cm 2激光功率照射這些細胞來拍攝四張近紅外圖像。首先，使用 850 nm 長通濾光片和 1100 nm 短通濾光片的組合，通過 1 秒曝光獲得850–1100 nm 圖像 (I 1 )。接下來，使用 5 秒曝光拍攝>1250 nm 圖像 (I 2 )。隨后，在添加 10 等分試樣后，獲得曝光 1 秒的“850–1100 nm + NaN 3 ”圖像 (I 3 ) 和曝光 5 秒的“>1250 nm + NaN 3 ”圖像 (I 4 )。毫米NaN 3加入樣品，輕輕攪拌，然后在黑暗中放置 5 分鐘。觀察到 850-1100 nm 信號略有下降，這可能表明存在一定程度的光漂白。然而，在 >1250 nm 圖像 (I 4 ) 中，添加 NaN 3后觀察到信號大幅下降。假設I 4圖像中的1O2信號幾乎完全猝滅，其主要由TMPyP的NIR背景發(fā)光形成。這四個圖像 I 1 –I 1的組合使研究人員能夠重建1O2發(fā)光的真實圖像。

這種新的實驗裝置采用近紅外敏感的二維 InGaAs 焦平面陣列作為檢測器，已證明足夠靈敏，可以產(chǎn)生與 TMPyP 孵育的單個D2O處理的成纖維細胞的1O2圖像和光譜圖像。該裝置1O2磷光檢測的總體效率估計為 1–3%。主要限制因素被確定為物鏡的數(shù)值孔徑(NA = 0.55)。使能技術(shù)據(jù) Scholz 博士介紹，NIRvana:640 相機(見圖 4)相對于以前使用的 1D InGaAs 探測器的主要優(yōu)勢在于 NIRvana 探測陣列的二維性，這使得采集時間大幅減少，并避免了一些樣品光漂白引起的問題。

圖 4：Princeton Instruments NIRvana:640 相機具有二維 InGaAs 檢測陣列，可熱電冷卻至 -85°C

NIRvana:640 是普林斯頓儀器公司專門為需要卓越線性度和卓越近紅外靈敏度的科學研究應用而設計的。其 640 x 512 InGaAs 檢測陣列可提供 0.9 μm 至 1.7 μm 的響應，可熱電冷卻至 –85°C，以最大程度地減少熱產(chǎn)生的噪聲并提高信噪比。為了量化其新顯微光譜裝置的性能參數(shù)，布拉格小組進行了一項實驗來確定 NIRvana:640(-80°C)的暗噪聲。結(jié)果如圖 5 所示。

圖 5：每幀不同曝光時間的每像素暗計數(shù)和標準差(NIRvana640 相機)。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 經(jīng)英國皇家化學學會 (RSC) 代表歐洲光生物學會、歐洲光化學協(xié)會和 RSC 許可復制。

NIRvana:640 InGaAs 相機還提供16 位數(shù)字化和低讀取噪聲，實現(xiàn)出色的動態(tài)范圍。此外，最新的 Princeton Instruments LightField? 64 位數(shù)據(jù)采集軟件(作為選件提供)可通過極其直觀的用戶界面完全控制所有 NIRvana 硬件功能。LightField 提供自動缺陷校正、精確曝光控制以及一系列創(chuàng)新功能，可輕松捕獲和導出成像和光譜數(shù)據(jù)。

概括

單線態(tài)氧是分子氧的第一激發(fā)態(tài)，是一種高活性物質(zhì)，在多種生物過程中發(fā)揮著重要作用，包括細胞信號傳導、免疫反應、大分子降解和光動力治療過程中腫瘤組織的消除。

通常，采用光敏過程從基態(tài)氧產(chǎn)生單線態(tài)氧。布拉格查爾斯大學開發(fā)和使用的創(chuàng)新實驗裝置現(xiàn)在允許研究人員對單線態(tài)氧進行直接、實時成像，同時解決與光敏劑發(fā)出的光潛在光譜重疊的問題。這種快速數(shù)據(jù)采集顯微光譜裝置依賴于 Princeton Instruments NIRvana:640 InGaAs 探測器的二維陣列和卓越的近紅外靈敏度。

審核編輯 黃宇