高通量液滴微流控芯片，用于輻射劑量的即時(shí)檢測(cè)

隨著核醫(yī)學(xué)、核電等核技術(shù)的廣泛應(yīng)用，意外核事故等突發(fā)公共事件發(fā)生的可能性顯著增加。機(jī)體受到高劑量電離輻射（》 1 Gy）后可導(dǎo)致急性放射綜合征（ARS）。ARS常涉及多種組織器官系統(tǒng)的損傷，輕則出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀，重則導(dǎo)致死亡。根據(jù)不同的臨床表現(xiàn)和結(jié)局，ARS一般分為造血系統(tǒng)型（2 Gy ~ 6 Gy）、胃腸型（6 Gy ~ 10 Gy）和腦型（》 10 Gy）等亞綜合征，與人體吸收的輻射劑量緊密相關(guān)。因此，輻射暴露人員受照劑量的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于放射事故后潛在暴露個(gè)體的醫(yī)學(xué)處置至關(guān)重要。在過(guò)去幾十年里，細(xì)胞微核和雙著絲粒測(cè)定等生物劑量測(cè)定方法已被用于輻射暴露的真實(shí)案例中。然而，這些檢測(cè)方法仍然存在一定的局限性，特別是檢測(cè)前需要最短48小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，因而難以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速和高通量等要求。因此，亟需發(fā)現(xiàn)新的更為高效的輻射劑量生物標(biāo)志物并開(kāi)發(fā)高通量檢測(cè)方法，以應(yīng)對(duì)突發(fā)放射性事件中潛在受照個(gè)體的大規(guī)模篩查、診斷和醫(yī)學(xué)分類。

近日，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院研究員周鋼橋/盧一鳴團(tuán)隊(duì)與北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院常凌乾課題組在Nature Communications和Biosensors & Bioelectronics期刊上發(fā)表系列研究工作，發(fā)現(xiàn)了基于RNA的N6-甲基腺苷（m6A）修飾的新型輻射劑量生物標(biāo)志物，并開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的高通量微流控芯片檢測(cè)方法。首先，周鋼橋/盧一鳴團(tuán)隊(duì)在Nature Communications期刊上發(fā)表了題為“RNA N6-methyladenosine modification-based biomarkers for absorbed ionizing radiation dose estimation”的研究論文。該研究首次發(fā)現(xiàn)了基于RNA m6A修飾的新型輻射暴露劑量生物標(biāo)志物，并建立了基于該修飾的人體輻射暴露劑量預(yù)測(cè)模型，為意外核事故后輻射暴露人員受照劑量的高通量測(cè)定和醫(yī)學(xué)分類提供了全新方案。

研究者首先對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中響應(yīng)電離輻射的mRNA分子進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組篩選，發(fā)現(xiàn)急性電離輻射暴露后RNA m6A水平發(fā)生顯著的變化。而且，與RNA轉(zhuǎn)錄水平相比，RNA m6A修飾水平的改變更加穩(wěn)定和持久，提示其更適合作為暴露后中長(zhǎng)期有效的輻射標(biāo)志物。其中，Ncoa4、Ate1和Fgf22三個(gè)基因的RNA m6A修飾水平在輻射暴露小鼠PBMC中表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，提示它們可以作為輻射暴露的生物標(biāo)志物。特別是，Ncoa4基因的RNA m6A在輻射暴露后長(zhǎng)達(dá)28天仍處于顯著升高狀態(tài)，提示其作為理想輻射標(biāo)志物的優(yōu)良表現(xiàn)。研究者進(jìn)一步排除了其他混雜因素，如炎癥、性別和年齡等對(duì)量效關(guān)系的影響，證明了其對(duì)電離輻射的反應(yīng)特異性。

研究者進(jìn)一步通過(guò)在小鼠、猴子和人類中的保守性分析發(fā)現(xiàn)，上述三個(gè)基因均具有跨物種高度保守的m6A修飾位點(diǎn)。尤其是，基于NCOA4基因中的保守m6A修飾位點(diǎn)，研究者分別建立了恒河猴、人類細(xì)胞系及人類PBMC的輻射暴露模型，發(fā)現(xiàn)在非人靈長(zhǎng)類和人類中NCOA4 m6A修飾水平仍然具有良好的量效關(guān)系。此外，研究者招募了33例接受局部放射治療的腫瘤患者，發(fā)現(xiàn)這些患者接受不同劑量放射治療后其PBMC中NCOA4 m6A修飾水平與受照劑量也具有良好的量效關(guān)系。

最后，研究者利用多因素非線性回歸模型構(gòu)建了基于NCOA4/Ncoa4 m6A修飾水平的輻射暴露劑量預(yù)測(cè)模型，可前瞻性準(zhǔn)確預(yù)測(cè)小鼠或人體吸收的輻射劑量。例如，該模型對(duì)于小鼠受照劑量的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度高達(dá)96.6%，對(duì)于臨床放療患者的受照劑量預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度達(dá)到90.1%。總之，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)基于RNA m6A修飾的候選輻射暴露標(biāo)志物，并建立了基于這些修飾的人體輻射暴露劑量預(yù)測(cè)模型，證明了RNA m6A修飾在輻射受照人員醫(yī)學(xué)分類和臨床應(yīng)用中的潛在可行性。

基于Ncoa4 m6A修飾水平的輻射暴露劑量預(yù)測(cè)模型

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院周鋼橋研究員和盧一鳴副研究員為論文的共同通訊作者；軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院陳紅霞副研究員、趙曦博士和解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心放射治療科楊微主治醫(yī)師為本文的共同第一作者。

為了進(jìn)一步高效檢測(cè)上述新發(fā)現(xiàn)的NCOA4 m6A修飾標(biāo)志物，軍事醫(yī)學(xué)研究院周鋼橋/盧一鳴團(tuán)隊(duì)與北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院常凌乾課題組合作，近日又在Biosensors & Bioelectronics期刊上發(fā)表了題為“Sensitive， rapid detection of NCOA4-m6A towards precisely quantifying radiation dosage on a Cas13a-Microdroplet platform”的研究論文。

該研究針對(duì)NCOA4 m6A修飾位點(diǎn)進(jìn)行靶向設(shè)計(jì)，并基于CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)設(shè)計(jì)了一種新型液滴微流控芯片系統(tǒng)（Cas13a-液滴微流控芯片平臺(tái)）。在原理上，該Cas13a-液滴微流控芯片平臺(tái)可產(chǎn)生均勻的微液滴，每個(gè)液滴中包裹了NCOA4 m6A和CRISPR/Cas13a檢測(cè)系統(tǒng)。其中，Cas13a可識(shí)別NCOA4 m6A修飾位點(diǎn)并進(jìn)一步切割熒光報(bào)告分子，在20分鐘內(nèi)即可產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)量陽(yáng)性液滴數(shù)的比例即可實(shí)現(xiàn)直觀的定量。此外，該平臺(tái)可使反應(yīng)體積從微升（μL）級(jí)減少到皮升（pL）級(jí)，從而能在比傳統(tǒng)方法更低的靶標(biāo)濃度下實(shí)現(xiàn)高度靈敏的定量檢測(cè)。該平臺(tái)的靈敏度和快速反應(yīng)性在受照小鼠模型和臨床放療患者樣本中都得到了驗(yàn)證。此外，與經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的m6A檢測(cè)方法MeRIP-qPCR相比，該微流控芯片平臺(tái)檢測(cè)NCOA4 m6A的靈敏度增加了兩倍。總之，軍事醫(yī)學(xué)研究院和北航兩個(gè)團(tuán)隊(duì)跨學(xué)科合作開(kāi)發(fā)的Cas13a-液滴微流控芯片平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)人體受照電離輻射劑量的快速、高靈敏度和高通量檢測(cè)，為輻射暴露人員受照劑量的高通量測(cè)定和醫(yī)學(xué)分類提供了全新的技術(shù)手段。

Cas13a-液滴微流控芯片平臺(tái)通過(guò)檢測(cè)NCOA4 m6A水平來(lái)確定輻射劑量的原理示意圖

北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院常凌乾教授、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院周鋼橋研究員、北航董再再助理教授為論文的共同通訊作者。北航碩士生靳致遠(yuǎn)、博士生杭欣欣、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院博士研究生趙曦和副研究員盧一鳴為本文的共同第一作者。

論文鏈接：

［1］https://doi.org/10.1038/s41467-023-42665-w

［2］https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115753