長(zhǎng)焦深、消色差超振蕩透鏡，實(shí)現(xiàn)多色超分辨立體顯微成像

超分辨顯微技術(shù)，是指具有超出傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)分辨率極限的顯微技術(shù)，其通過采用多種創(chuàng)新的近場(chǎng)或遠(yuǎn)場(chǎng)的激發(fā)與探測(cè)技術(shù)，獲取物體散射光場(chǎng)的高頻分量或減小照明光斑和收集區(qū)域，進(jìn)而打破傳統(tǒng)顯微鏡的阿貝-瑞利衍射極限限制，獲得觀察并記錄微觀世界中更微小、更精細(xì)的結(jié)構(gòu)的能力。超分辨顯微技術(shù)在生命科學(xué)、材料科學(xué)、納米技術(shù)和其它相關(guān)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。

超振蕩透鏡（Super-oscillatory lens），是指通過微納結(jié)構(gòu)對(duì)光場(chǎng)的波前進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，在特定位置可獲得比透鏡數(shù)值孔徑對(duì)應(yīng)空間頻率更高的空間頻率分量，進(jìn)而獲得超分辨聚焦能力的一種新型平面衍射透鏡。

焦深，對(duì)成像系統(tǒng)來講指在其焦點(diǎn)附近像可保持相對(duì)清晰的范圍；對(duì)于聚焦透鏡來講指其聚焦光斑可被用于照明的光軸方向的范圍。焦深決定了圖像深度信息的獲取。

消色差，是指透鏡克服色差的能力。色差是當(dāng)光線穿過透鏡或衍射光學(xué)元件時(shí)，不同顏色的光匯聚在不同位置的現(xiàn)象。消色差是平面衍射透鏡的主要研究方向之一，對(duì)成像及生物樣本光譜采集至關(guān)重要。

超振蕩顯微成像技術(shù)，是指以超振蕩透鏡為照明系統(tǒng)替代傳統(tǒng)透鏡，以共聚焦顯微系統(tǒng)為基本框架搭建的超分辨顯微成像系統(tǒng)。相較于傳統(tǒng)的超分辨顯微技術(shù)，其定制化的光場(chǎng)分布有望在遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨的基礎(chǔ)上同時(shí)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)焦深和消色差。

目前超振蕩透鏡仍存在幾個(gè)亟需解決的問題：

高數(shù)值孔徑引起的高度光場(chǎng)壓縮，導(dǎo)致相對(duì)較短的焦深；

高強(qiáng)度的旁瓣導(dǎo)致超振蕩透鏡的視場(chǎng)相對(duì)較??；

光的波動(dòng)性導(dǎo)致的衍射色差；

數(shù)十微米左右的工作距離（焦距），導(dǎo)致應(yīng)用場(chǎng)景受限。

因此，設(shè)計(jì)一種同時(shí)滿足消色差、超分辨、超大工作距離、長(zhǎng)焦深且可低成本、晶圓級(jí)制造的高數(shù)值孔徑平面光學(xué)透鏡是當(dāng)前研究的關(guān)鍵難題，亟需解決以滿足其在超分辨顯微鏡關(guān)鍵裝備中不斷升級(jí)的成像與檢測(cè)需求，新一代“完美透鏡”革命蓄勢(shì)待發(fā)。

近日，西北工業(yè)大學(xué)機(jī)電學(xué)院微系統(tǒng)工程系與香港城市大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院合作在平面超分辨多色立體顯微成像研究中取得重要進(jìn)展，相關(guān)研究成果以“Super-resolution multicolor fluorescence microscopy enabled by an apochromatic super-oscillatory lens with extended depth-of-focus”為題發(fā)表在Nature Communications。西北工業(yè)大學(xué)苑偉政教授與虞益挺教授聯(lián)合培養(yǎng)的博士后李文麗為該論文的第一作者，機(jī)電學(xué)院與寧波研究院為第一作者單位。虞益挺教授與雷黨愿教授為本文的通訊作者。

針對(duì)光學(xué)透鏡在帶寬、視場(chǎng)與分辨率之間存在的突出瓶頸，以平面超振蕩透鏡為研究對(duì)象，提出多焦點(diǎn)拼接延長(zhǎng)焦深及多波長(zhǎng)復(fù)消色差可控優(yōu)化設(shè)計(jì)方法，實(shí)現(xiàn)了0.76數(shù)值孔徑、428 μm大工作距離、聚焦效率>11.2%，三波長(zhǎng)（488nm /532nm /640nm）激發(fā)下焦深均大于10倍波長(zhǎng)的光針光場(chǎng)，整體表現(xiàn)超過了現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。將藍(lán)、綠、紅三束遠(yuǎn)場(chǎng)光針光場(chǎng)重疊，可實(shí)現(xiàn)多波長(zhǎng)超分辨立體顯微成像：通過分辨率標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，量化了超振蕩透鏡的超分辨能力（空氣中488nm入射波長(zhǎng)可實(shí)現(xiàn)0.3λ的分辨率）；通過無軸向面內(nèi)掃描，實(shí)現(xiàn)對(duì)三維楔形結(jié)構(gòu)的立體成像；此外，還展示了對(duì)一定厚度的生物樣品進(jìn)行多波長(zhǎng)熒光成像的能力。這些功能是商用明場(chǎng)顯微鏡及共聚焦顯微鏡無法實(shí)現(xiàn)的。

多焦點(diǎn)拼接延長(zhǎng)焦深及多波長(zhǎng)復(fù)消色差可控優(yōu)化設(shè)計(jì)方法

傳統(tǒng)衍射光學(xué)元件中存在著一個(gè)與數(shù)值孔徑相關(guān)的內(nèi)在制約關(guān)系，涉及焦深、焦斑尺寸和色差。針對(duì)該制約關(guān)系，我們建立了一種新的多目標(biāo)優(yōu)化策略，以達(dá)到優(yōu)化、權(quán)衡該制約關(guān)系的目的；在實(shí)現(xiàn)超分辨的同時(shí)，最大程度地增長(zhǎng)焦深并減小色散。首先通過軸向聯(lián)合多焦點(diǎn)方法擴(kuò)展焦深，并在各個(gè)波長(zhǎng)的情況下（如圖1所示）將旁瓣強(qiáng)度以及主瓣半峰寬最小化，然后使三個(gè)不同波長(zhǎng)（例如藍(lán)光、綠光和紅光）生成的次衍射“針狀”光場(chǎng)在空間上重疊。優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果突破了經(jīng)典光學(xué)理論中帶寬、視場(chǎng)與分辨率之間的固有矛盾，實(shí)現(xiàn)了軸向均勻、旁瓣抑制的消色差超振蕩透鏡，數(shù)值孔徑為0.76，在428 μm焦距下的聚焦效率為11.2%，在三個(gè)入射波長(zhǎng)（488nm/532nm/640nm）下的焦深均大于10倍波長(zhǎng)，處于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的領(lǐng)先水平。

圖1：多焦點(diǎn)拼接延長(zhǎng)焦深及多波長(zhǎng)復(fù)消色差可控優(yōu)化設(shè)計(jì)方法

無需軸向掃描的多色超分辨立體顯微成像

基于多目標(biāo)優(yōu)化策略設(shè)計(jì)的超振蕩透鏡，將藍(lán)、綠、紅三束遠(yuǎn)場(chǎng)光針光場(chǎng)在焦平面重疊，搭建了多色超分辨立體顯微成像系統(tǒng)。通過對(duì)分辨率板進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)在空氣中無標(biāo)記成像遠(yuǎn)場(chǎng)分辨率極限可達(dá)到0.3λ（入射波長(zhǎng)488nm）（如圖2所示）。

圖2：多色超分辨立體顯微成像系統(tǒng)對(duì)分辨率板的成像效果

不僅如此，優(yōu)越的長(zhǎng)焦深特性更賦予了成像系統(tǒng)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，使其能夠一次性捕獲三維物體的整體細(xì)節(jié)，而不需要額外的軸向（垂向）掃描。如圖3所示，研究人員成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)微納加工的三維楔形結(jié)構(gòu)的立體成像。

圖3：多色超分辨立體顯微成像系統(tǒng)對(duì)三維楔形結(jié)構(gòu)的成像效果

雙色熒光立體成像

當(dāng)觀察神經(jīng)元的內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)時(shí)，內(nèi)部突觸總是位于不同的深度。為了能夠?qū)崟r(shí)繪制神經(jīng)元活動(dòng)，具有高空間分辨率、大景深和消色差的照明透鏡將體現(xiàn)出更多成像優(yōu)勢(shì)。我們搭建的多波長(zhǎng)超分辨立體顯微成像系統(tǒng)可以同時(shí)滿足這些功能需求。圖4展示了對(duì)兩種染料同時(shí)標(biāo)記的人類神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行成像結(jié)果，表明：相比傳統(tǒng)大數(shù)值孔徑（NA=0.9）的寬場(chǎng)成像，該系統(tǒng)可在獲得高分辨率和雙色圖像的同時(shí)，還可捕獲了更深層部位的信息。另一方面，超振蕩透鏡的聚焦能量分布可以在主瓣和旁瓣之間進(jìn)行靈活的定制設(shè)計(jì)，一方面有利于減少對(duì)生物樣品的光損傷，另一方面為光學(xué)成像系統(tǒng)的定制化提供了便利。

圖4：傳統(tǒng)寬場(chǎng)成像和多色超分辨立體顯微成像系統(tǒng)對(duì)人類神經(jīng)元成像效果對(duì)比

總結(jié)與展望

高數(shù)值孔徑的長(zhǎng)焦深、消色差超振蕩透鏡將促進(jìn)超振蕩透鏡在眾多領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用，如非侵入性的三維生物醫(yī)學(xué)成像、激光光束控制、多色光學(xué)相干斷層掃描成像、光譜顯微成像、芯片上實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及微納米加工。超振蕩透鏡所提供的定制光場(chǎng)模式在遠(yuǎn)場(chǎng)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，將使生物成像更加靈活和高效。

它的未來挑戰(zhàn)和展望包括以下幾個(gè)方面：

更廣波長(zhǎng)范圍的應(yīng)用：目前多數(shù)超振蕩透鏡針對(duì)特定波長(zhǎng)范圍進(jìn)行設(shè)計(jì)，未來的挑戰(zhàn)之一是擴(kuò)展其適用波長(zhǎng)范圍，以滿足多種應(yīng)用需求，包括多光譜成像和光譜分析。

更大數(shù)值孔徑：提高數(shù)值孔徑有助于提高分辨率和靈敏度，但也增加了設(shè)計(jì)和制造的復(fù)雜性。未來的設(shè)計(jì)與加工需要克服這些技術(shù)挑戰(zhàn)，實(shí)現(xiàn)更大數(shù)值孔徑的超振蕩透鏡。

多模式操作：實(shí)現(xiàn)超振蕩透鏡的多模式操作，允許在不同成像條件下切換，將增加其多功能性，但也需要更復(fù)雜的控制和反饋系統(tǒng)。

成像系統(tǒng)集成：將超振蕩透鏡集成到各種成像系統(tǒng)中，如顯微鏡、相機(jī)和其它光學(xué)設(shè)備，以簡(jiǎn)化使用并擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域。

論文信息

Li, W., He, P., Lei, D. et al. Super-resolution multicolor fluorescence microscopy enabled by an apochromatic super-oscillatory lens with extended depth-of-focus. Nat Commun 14, 5107 (2023).

審核編輯：黃飛