用于數(shù)字DNA擴(kuò)增的集成化多功能液滴微流控平臺開發(fā)

近年來，腫瘤早期診斷研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展。其中核酸標(biāo)記物在液體活檢中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠提供關(guān)于治療響應(yīng)、腫瘤復(fù)發(fā)以及腫瘤內(nèi)異質(zhì)性等方面的重要信息。數(shù)字DNA擴(kuò)增技術(shù)作為一種可靠且準(zhǔn)確的液體活檢工具，能夠在不依賴標(biāo)準(zhǔn)參考物的情況下對微量核酸分子進(jìn)行絕對定量。為了實(shí)現(xiàn)數(shù)字DNA擴(kuò)增的單分子分辨率，需要將檢測樣本分隔到系統(tǒng)內(nèi)的獨(dú)立區(qū)室進(jìn)行擴(kuò)增，并通過計(jì)數(shù)和分析陽性區(qū)室的數(shù)量和熒光強(qiáng)度來確定目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。

目前，數(shù)字PCR中的分區(qū)實(shí)現(xiàn)主要依賴于基于腔室的微流控技術(shù)和基于液滴的微流控技術(shù)?；谇皇业姆椒ㄍㄟ^泵或閥門將樣本引入數(shù)萬個反應(yīng)腔室的陣列中。而基于液滴的方法則通過注射泵、離心力或氣動力生成反應(yīng)腔室，從而可以創(chuàng)建理論上無限數(shù)量的腔室，提供了更高的靈活性和更廣的動態(tài)范圍，以提高檢測能力。然而，現(xiàn)有的數(shù)字PCR儀往往依賴于昂貴的商業(yè)系統(tǒng)或?qū)Ｓ迷O(shè)備，導(dǎo)致成本居高不下。此外，檢測過程中需要在不同設(shè)備之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，存在交叉污染的風(fēng)險，并且液滴損失可能導(dǎo)致目標(biāo)定量低估。

因此，無論是市場還是臨床，都迫切需要一種集成化的微流控平臺，以滿足數(shù)字DNA擴(kuò)增在液體活檢中的用戶需求，推動液體活檢在癌癥診療中的廣泛應(yīng)用，并為個性化醫(yī)療和治療監(jiān)測提供更可靠的工具。該平臺應(yīng)具備獨(dú)立區(qū)室進(jìn)行擴(kuò)增的能力，并能夠通過計(jì)數(shù)和分析陽性區(qū)室的數(shù)量和熒光強(qiáng)度來確定目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。同時，該平臺應(yīng)減少操作過程中交叉污染的風(fēng)險和液滴損失導(dǎo)致的目標(biāo)定量低估。此外，該平臺應(yīng)具備較高的靈活性和更廣的動態(tài)范圍，以適應(yīng)不同的檢測需求。

為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，近期，香港城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系、香港大學(xué)臨床腫瘤學(xué)系、晶準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的聯(lián)合科研團(tuán)隊(duì)發(fā)表了一篇利用集成化多功能的液滴微流控技術(shù)平臺實(shí)現(xiàn)數(shù)字DNA擴(kuò)增的研究文章，提供了一種快速高效的數(shù)字DNA擴(kuò)增解決方案。相關(guān)研究內(nèi)容以“An integrated and multi-functional droplet-based microfluidic platform for digital DNA amplification”為題發(fā)表在國際權(quán)威雜志Biosensors and Bioelectronic上。

高集成多功能微流控芯片的設(shè)計(jì)

首先，為了實(shí)現(xiàn)一個高度集成和多功能的微流控平臺，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種特殊的芯片結(jié)構(gòu)，如圖1所示。該芯片結(jié)構(gòu)包括連續(xù)相（油）的進(jìn)口、水相（樣品）的進(jìn)口、用于生成液滴的流動聚焦結(jié)構(gòu)、樹狀結(jié)構(gòu)分割通道，以及用于原位擴(kuò)增和檢測的收集室。這種設(shè)計(jì)不僅能實(shí)現(xiàn)高通量的液滴生成，還能保證反應(yīng)過程的一體化。

特別需要注意的是，為了克服PDMS材料的多孔性以及透氣性帶來的挑戰(zhàn)，研究團(tuán)隊(duì)采用了三明治的芯片結(jié)構(gòu)制造方法。底部玻璃載板用于支撐芯片，PDMS芯片用于液滴的生成和擴(kuò)增發(fā)生以及信號檢測，并添加了硅油進(jìn)行預(yù)飽和，以防止液滴的蒸發(fā)。頂部的玻璃蓋片則能夠有效防止樣品在熱循環(huán)過程中的蒸發(fā)和損失。

此外，研究團(tuán)隊(duì)巧妙地設(shè)計(jì)了魯爾接頭拼接，以提供方便的樣品裝載和壓力控制，并在接頭內(nèi)部設(shè)置油相儲備以提供密封保護(hù)。這種設(shè)計(jì)方法不僅有效地克服了PDMS材料多孔性導(dǎo)致的液滴蒸發(fā)挑戰(zhàn)，還確保了擴(kuò)增信號的一體化檢測。同時，所采用的低成本制造方法也易于實(shí)施。

圖1 基于液滴的數(shù)字DNA擴(kuò)增的全集成多功能平臺示意圖

微液滴生成及穩(wěn)定性優(yōu)化

液滴的大小、形狀和均一性對于高通量操作至關(guān)重要。為了提高液滴生成的通量和效率，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種樹狀結(jié)構(gòu)分割通道，通過將大液滴等分為兩個較小的液滴，并通過分割角度和控制連續(xù)相和分散相的流速比，實(shí)現(xiàn)了對液滴尺寸的精確均一控制，使得該芯片設(shè)計(jì)在穩(wěn)定性和功能性方面表現(xiàn)出色，能夠?qū)崿F(xiàn)對液滴的精確控制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的基礎(chǔ)。

為了保持液滴的穩(wěn)定性，在熱循環(huán)過程中，研究團(tuán)隊(duì)采取了一系列優(yōu)化設(shè)計(jì)。首先，通過硅油預(yù)飽和PDMS，避免了油相在熱循環(huán)中的吸收。其次，通過對不同濃度的表面活性劑的測試優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了液滴在熱循環(huán)過程中的穩(wěn)定，并且對DNA擴(kuò)增的性能影響較小。

綜上所述，通過改進(jìn)和驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了微流控系統(tǒng)中液滴生成和穩(wěn)定性的提升。在擴(kuò)增熱循環(huán)后，超過90%的液滴保持了其原始形狀和狀態(tài)，表明該技術(shù)平臺在液滴的穩(wěn)定性方面具有良好效果。

圖2 微流控系統(tǒng)中液滴生成和穩(wěn)定性的優(yōu)化與驗(yàn)證示意圖

目標(biāo)分子檢測驗(yàn)證

最后，研究團(tuán)隊(duì)使用數(shù)字PCR（dPCR）和數(shù)字LAMP（dLAMP），針對兩種突變進(jìn)行了檢測：EGFR外顯子20突變和HPV-16突變驗(yàn)證了該技術(shù)平臺在DNA擴(kuò)增中的可行性。EGFR外顯子20基因突變在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中約占5% ~ 10％，而HPV感染是宮頸癌的主要原因，其中HPV-16是最常見的高危型，準(zhǔn)確檢測對于指導(dǎo)治療以及改善預(yù)后至關(guān)重要。圖3結(jié)果顯示，通過數(shù)字PCR和數(shù)字LAMP，在擴(kuò)增后，含有目標(biāo)分子的液滴顯示出比其他液滴更高的熒光信號，表明目標(biāo)分子的有效擴(kuò)增。通過計(jì)算正熒光信號和負(fù)熒光信號的液滴數(shù)量，確定樣品的濃度。研究人員還使用了一定的閾值來排除擴(kuò)增后由于液滴聚集而形成的大液滴。研究結(jié)果顯示，測量值與預(yù)期值之間呈現(xiàn)出線性、統(tǒng)計(jì)顯著的相關(guān)性。通過Poisson統(tǒng)計(jì)，測量值與預(yù)期值之間得到很好的匹配。

研究人員還將開發(fā)的平臺的結(jié)果與商業(yè)平臺的結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在高度一致性，這表明該平臺作為數(shù)字DNA擴(kuò)增的可行替代品具有準(zhǔn)確性和可靠性。

圖3 集成化多功能的平臺在DNA擴(kuò)增中的表現(xiàn)示意圖

綜上所述，在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)成功開發(fā)出一款多功能的、易于操作的基于液滴的微流控平臺，用于進(jìn)行數(shù)字DNA擴(kuò)增，可用于數(shù)字PCR技術(shù)平臺。該技術(shù)將液滴制備、擴(kuò)增及熒光信號檢測進(jìn)行了集成，從而克服了現(xiàn)有方法的局限性。這一改進(jìn)不僅簡化了工作流程，還在微制造方面降低了成本。該平臺易于制造和操作，適用于廣泛的用戶，進(jìn)一步增加了其實(shí)用性。

此平臺實(shí)現(xiàn)了高通量的微液滴生成，能在5分鐘內(nèi)將40 μL樣品分配到超過50,000個均勻大小的微滴中（變異性< 2%）。包含目標(biāo)分子的微液滴在擴(kuò)增循環(huán)過程中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，并且能夠穩(wěn)定信號一段時間用于后續(xù)檢測。該平臺展示了處理多種目標(biāo)和擴(kuò)增方法的能力和可行性。

在對等溫和PCR的核酸定量方面，該平臺表現(xiàn)出了高靈敏度和準(zhǔn)確性，顯示出巨大的潛力。該平臺有望通過幫助識別更多符合靶向治療條件的突變患者，并提供非侵入性監(jiān)測方法，對個體化醫(yī)學(xué)產(chǎn)生重大影響，并改善患者護(hù)理。此項(xiàng)工作具有創(chuàng)新性和重要意義，為未來的研究和臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。







審核編輯：劉清