淺談超分辨光學(xué)成像

分辨光學(xué)定義及應(yīng)用

分辨光學(xué)成像特指分辨率打破了光學(xué)顯微鏡分辨率極限(200nm)的顯微鏡，技術(shù)原理主要有受激發(fā)射損耗顯微鏡技術(shù)和光激活定位顯微鏡技術(shù)。

管中亦可窺豹——受激發(fā)射損耗顯微鏡

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡采用寬場成像的方式，照明光一次照亮整個成像范圍，然后用相機(jī)對整個成像范圍進(jìn)行曝光成像，一次獲得整幅圖像?！肮苤懈Q豹”型的掃描成像則有所不同，照明光聚焦在樣品上，形成一個極小的光點(diǎn)——也就是所謂的“管”，每次只對光點(diǎn)對應(yīng)的區(qū)域進(jìn)行成像;當(dāng)我們改變光點(diǎn)的位置，使它依次掃遍整個樣品，也就獲得了一幅完整的圖像。有人要問了，即使采用“管中窺豹”的方式，每次聚焦的光點(diǎn)依然受到衍射極限限制，系統(tǒng)分辨能力比起所謂的寬場成像沒有提高，掃描過程又增加了系統(tǒng)的復(fù)雜度，不是自找麻煩嗎?Stefan W. Hell的回答很簡單：只要設(shè)法縮小“管中窺豹”的“管”，就能提高系統(tǒng)的分辨能力，實(shí)現(xiàn)超分辨。

通常的熒光成像是這樣的：熒光分子在吸收了照明光(或者叫激發(fā)光)A之后，會在很短的時間持續(xù)發(fā)出熒光B。掃描成像系統(tǒng)的分辨能力取決于A在樣品處的聚焦光點(diǎn)大小。Hell找到了熒光的開關(guān)——第三種光C，在C的照射下，熒光分子即使吸收了激發(fā)光A，也沒法再發(fā)出熒光B。Hell讓開關(guān)C同樣打在樣品上，形成一個四周亮、中心暗的“面包圈”，“面包圈”中心的暗區(qū)域比艾里斑還要小;然后把面包圈套在艾里斑上，就像在“管”的出口又加了一個小孔，使“管”的直徑大大減少，也就提高了整臺顯微鏡的分辨能力。

“面包圈”限制了激發(fā)光A的有效范圍

“我只看到星星”“我看到了銀河”——光激活定位顯微

熒光分子是熒光樣品的最小發(fā)光單元，由于衍射極限的限制，在相鄰的兩個熒光分子同時點(diǎn)亮?xí)r，我們只能看到一個光斑，但如果每次只點(diǎn)亮一個分子，就可以通過光斑，計算得到熒光分子的準(zhǔn)確位置。

Eric Betzig和William E. Moerner采用的就是這樣一種方法，如果說STED技術(shù)核心是“擦除”，那么PALM技術(shù)的核心就是“定位”：Moerner發(fā)現(xiàn)存在光D可以“打開”熒光。通過控制D的照射劑量，保證每次只有少量熒光分子處在打開狀態(tài);當(dāng)熒光分子在開與關(guān)之間切換時，整幅圖像中的熒光信號就會像銀河中的星星一樣亮暗閃爍，只要進(jìn)行足夠多次的開關(guān)和成像，就可以組合出整個樣品的圖像。

溶酶體膜在不同顯微鏡下的成像結(jié)果。(左)傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡成像;(中)光激活定位顯微鏡成像;(右)放大的光激活定位顯微鏡成像。

參考使用產(chǎn)品

美國普林斯頓公司-FERGIE

特點(diǎn)：

· 無像差光學(xué)設(shè)計,完全沒有彗形相差;

· FERGIE特有的光學(xué)設(shè)計可產(chǎn)生衍射極限圖像，適用于從紫外到近紅外波長的微光光譜應(yīng)用;

· 集成TE冷卻背照式CCD，制冷低至-55°C，允許長的積分時間來檢測微弱的信號;

· 幀轉(zhuǎn)移CCD架構(gòu)，1kHz的頻率捕獲光譜速率(合并10行);

· 基于FPGA的內(nèi)部定時發(fā)生器;

· 動力學(xué)光譜模式，擁有微秒時間分辨率。

美國普林斯頓公司-IsoPlance

特點(diǎn)：

· 無雜散光設(shè)計;

· 出色的成像性能;

· 高光通量;

· 動力學(xué)塔輪，支持三個光柵，軟件控制自動旋轉(zhuǎn);

· 高效率光學(xué)鍍膜，可選的銀，金或介電涂層的反射率為98%。

審核編輯 黃宇