基于微流控的納米細胞芯片，用于肺癌免疫治療的精準(zhǔn)預(yù)測

免疫療法是臨床上最具有前景的腫瘤治療方式之一。該療法采用PD-L1抑制劑等免疫檢查點抑制劑（ICI），重新激活癌癥患者體的免疫細胞，提高對腫瘤細胞的識別和清除能力。但在臨床中，僅有部分患者能從免疫治療中獲益。大量研究表明，使用單一生物標(biāo)記物，如PD-L1表達，并無法準(zhǔn)確預(yù)測患者對ICI的反饋。臨床常規(guī)組織活檢方式，受限于取樣位置和動態(tài)分析，無法提供足夠精細的時空信息，也無法準(zhǔn)確評估腫瘤的異質(zhì)性，導(dǎo)致對腫瘤發(fā)生和免疫治療過程中的細胞反應(yīng)知之甚少。如何精準(zhǔn)預(yù)測免疫治療的療效，成為了提高免疫治療效率亟待解決的首要問題。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，針對該臨床問題，北京航空航天大學(xué)常凌乾教授團隊，與北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院吳楠教授、格拉斯哥大學(xué)Jonathan M. Cooper教授、北京機械設(shè)備研究所楊明珠研究員等合作，報道了一種循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）捕獲、原位培養(yǎng)和基因分析芯片系統(tǒng)，命名為“NICHE”。NICHE系統(tǒng)從PD-L1基因表達、腫瘤細胞響應(yīng)免疫細胞的行為表型，對患者來源的循環(huán)腫瘤細胞進行劃分，實現(xiàn)了肺癌患者對免疫療法的精準(zhǔn)預(yù)測，臨床準(zhǔn)確率（AUC值）達到90%以上。成果以“Genetic and phenotypic profiling of single living circulating tumor cells from patients with microfluidics”為題，發(fā)表在《PNAS》期刊上。該論文第一作者為北航醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院董再再（助理教授）、北航生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院汪于森碩士、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院劉冰博士、上海市感染和免疫疾病科技創(chuàng)新中心徐高連教授。

圖1. 循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）捕獲、原位培養(yǎng)和基因分析芯片系統(tǒng)NICHE，用于肺癌免疫治療的精準(zhǔn)預(yù)測與監(jiān)測。

該納米細胞芯片采用磁場和細胞尺寸，高效去除（> 93%）血樣中的白細胞，并捕獲循環(huán)腫瘤細胞使其形成單細胞陣列（>95%）。為了實現(xiàn)活循環(huán)腫瘤細胞內(nèi)PD-L1基因的準(zhǔn)確檢測，研究者們設(shè)計了一種具有四面體結(jié)構(gòu)的探針（DNAT），該探針的三條邊上的識別序列分別用于識別3種不同的mRNA，通過不同的熒光標(biāo)記，實現(xiàn)了PD-L1基因、內(nèi)參GAPDH基因，以及循環(huán)腫瘤細胞鑒定基因的同時檢測。DNAT探針具有良好的特異性，且能長時間抵抗核酸酶的降解。利用納米電穿孔技術(shù)，該探針能在2秒內(nèi)實現(xiàn)對95%以上細胞的遞送，且細胞保持良好的活性（90%），與其他常規(guī)方法相比，納米電穿孔技術(shù)展示出更高的遞送性能（圖2）。

圖2. 在單個活細胞水平循環(huán)腫瘤細胞內(nèi)PD-L1 mRNA的精準(zhǔn)量化。

基因檢測始終，循環(huán)腫瘤細胞保持良好的活性。通過與免疫T細胞的共培養(yǎng)，研究者們發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤細胞在免疫抑制劑存在時，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變長，且細胞增殖行為被顯著抑制（圖3）。根據(jù)腫瘤細胞PD-L1的表達情況，研究者們劃分出了PD-L1高表達與低表達的閾值；另外，根據(jù)腫瘤細胞與免疫細胞共培養(yǎng)的結(jié)果，研究者們劃分出了腫瘤細胞形態(tài)發(fā)生變化的閾值。綜合循環(huán)腫瘤細胞中PD-L1高表達（PD-L1high）且表型發(fā)生變化（PA+）的占比，該研究定義了一種新的指標(biāo)，“NICHE指數(shù)”，用于預(yù)測癌癥患者響應(yīng)免疫療法的療效。

圖3. 循環(huán)腫瘤細胞與免疫細胞共培養(yǎng)下發(fā)生形態(tài)改變。

為了評估NICHE在臨床上預(yù)測免疫療效的性能，該研究收集了80名非小細胞肺癌患者的外周血，通過在NICHE平臺上的檢測，證明了該平臺捕獲循環(huán)腫瘤細胞 并鑒定其基因和行為表型的能力（圖4）。從方法對比結(jié)果來看，該研究提出的NICHE指數(shù)表現(xiàn)出高準(zhǔn)確性，其AUC（0.906）明顯高于目前臨床上基于腫瘤組織中PD-L1表達細胞占比的標(biāo)準(zhǔn)參考方法（AUC=0.578）。此外，研究者們還對部分患者進行了長時間的用藥監(jiān)測，證實了NICHE在長期監(jiān)測中的適用性。

圖4. 采用NICHE系統(tǒng)對肺癌血樣中的循環(huán)腫瘤細胞進行捕獲與分析，并實現(xiàn)了患者免疫治療的精準(zhǔn)預(yù)測。

文章鏈接：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2315168121