一種具有長(zhǎng)效抗菌效果的活性益生菌微針貼片，用于治療慢性感染傷口

傷口感染是指?jìng)谠谟线^(guò)程中仍被細(xì)菌或其他微生物感染的疾病。與急性傷口不同，慢性感染性傷口通常經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的愈合過(guò)程仍無(wú)法完全愈合，給患者帶來(lái)了嚴(yán)重的后果和沉重的負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)上，感染傷口的治療方法主要包括定期傷口清創(chuàng)、口服抗生素、抗菌敷料等。但是這些方法都有一定的局限。首先，細(xì)菌在傷口部位產(chǎn)生的生物膜形成物理屏障，限制抗菌劑或生物大分子滲透到深部組織，從而顯著降低藥物遞送效率；其次，抗生素的誤用和過(guò)度使用是增加抗生素耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的主要驅(qū)動(dòng)因素，抗生素耐藥性已成為嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題；此外，頻繁更換敷料，可能會(huì)導(dǎo)致傷口疼痛和繼發(fā)性損傷，從而顯著降低患者的依從性。因此，非常需要研發(fā)一種新的傷口愈合治療策略。

基于此，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種具有長(zhǎng)效抗菌效果的活性益生菌微針貼片，用于治療慢性感染傷口。該微針貼片是利用3D打印設(shè)備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成，相關(guān)研究成果以“Accelerated infected wound healing by probiotic-based living microneedles with long-acting antibacterial effect”為題發(fā)表在期刊《Bioactive Materials》上。武漢大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生靳銀麗、武漢大學(xué)中南醫(yī)院藥劑科盧云、武漢大學(xué)藥學(xué)院博士研究生江雪為共同第一作者，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授、武漢大學(xué)中南醫(yī)院整形美容科郭亮主任醫(yī)師為共同通訊作者。

該微針貼片（5% GL MN）由聚乙烯醇（PVA）、蔗糖、5%甘油和羅伊氏乳桿菌制成。其中，PVA-蔗糖基質(zhì)為5% GL MN提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度，促進(jìn)5% GL MN在插入皮膚后快速溶解，從而實(shí)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌的快速遞送；羅伊氏乳桿菌可以代謝甘油產(chǎn)生具有抗菌作用的羅氏菌素，從而在慢性感染傷口處實(shí)現(xiàn)抗菌、減少炎癥、促進(jìn)傷口愈合的作用。值得注意的是，在5% GL MN中加入的甘油不僅不影響羅伊氏乳桿菌的存活，而且還為羅伊氏乳桿菌持續(xù)產(chǎn)生羅氏菌素提供了充分來(lái)源，從而在傷口深處實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抗菌和抗炎作用。

圖1 用于慢性感染傷口愈合的5% GL MN示意圖

研究人員首先采用真空輔助微成型方法制備GL MN貼片，并對(duì)微針的形貌、機(jī)械強(qiáng)度、穿刺皮膚的能力、溶解速度以及釋藥效率等進(jìn)行一系列表征。

圖2 GL MN貼片的制造和表征

制備的GL MN貼片結(jié)構(gòu)為基底半徑200 μm，高度850 μm，尖端半徑~10 μm的錐形，微針排列成10 × 10陣列，面積為7 mm × 7 mm。羅伊氏乳桿菌以良好的形態(tài)封裝在微針內(nèi)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）結(jié)果顯示，羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的物質(zhì)中存在與3-羥基丙醛（3-HPA）相對(duì)應(yīng)的分子離子峰（M=74.0607），這表明羅伊氏乳桿菌具有產(chǎn)生抗菌物質(zhì)羅氏菌素的能力。定量分析表明，5% GL MN中的羅伊氏乳桿菌能產(chǎn)生更多的羅氏菌素。而羅氏菌素可以引起大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的顯著形態(tài)變化，據(jù)推測(cè)，羅氏菌素通過(guò)抑制細(xì)菌核糖核苷酸還原酶的活性，而核糖核苷酸還原酶對(duì)DNA合成至關(guān)重要，從而實(shí)現(xiàn)廣譜抗菌活性。

圖3 5% GL MN貼片的表征和羅氏菌素的抗菌作用

隨后，為了進(jìn)一步評(píng)估5% GL MN貼片的抗菌效果，通過(guò)細(xì)菌的活死染色實(shí)驗(yàn)、平板涂布和抑菌圈實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證5% GL MN貼片具有良好的抗菌效果。此外，5% GL MN貼片在體外也顯示出有效的金黃色葡萄球菌生物膜清除率，這通常在有害細(xì)菌的耐藥性中起關(guān)鍵作用。

圖4 5% GL MN貼片在體外的抗菌作用

圖5 5% GL MN貼片體外的生物膜清除效果

緊接著，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）、蛋白質(zhì)印跡（WB）驗(yàn)證了基于羅伊氏乳桿菌GL MN貼片的抗炎作用。

圖6 體外GL MN貼片的抗炎特性

基于GL MN貼片的形態(tài)、皮膚穿透能力、機(jī)械強(qiáng)度、溶解速度和抗菌功效等方面的表征，確定5% GL MN是遞送羅伊氏乳桿菌到傷口處進(jìn)行抗菌的最佳方案。之后，細(xì)胞活死染色實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)證明了5% GL MN貼片在體外具有優(yōu)異的生物相容性。羅伊氏乳桿菌在5% GL MN貼片中的穩(wěn)定性對(duì)于維持其抗菌活性至關(guān)重要，將5% GL MN貼片在4℃和25℃下分別保存，羅伊氏乳桿菌在室溫下可在5% GL MN貼片中存活7天，超過(guò)40%的活菌保留在貼片中；將貼片置于4℃時(shí)，羅伊氏乳桿菌在60天后仍保持高活力（>80%），這表明羅伊氏乳桿菌在5% GL MN貼片中具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

圖7 5% GL MN貼片的細(xì)胞毒性和穩(wěn)定性

然后，在小鼠身上建立全層皮膚傷口模型，將5% GL MN貼片施用于傷口處，可以看到5% GL MN貼片可以促進(jìn)傷口的愈合，并且對(duì)傷口處的金黃色葡萄球菌有持續(xù)的抑制作用。

圖8 5% GL MN貼片在體內(nèi)的抗菌作用

最后，對(duì)小鼠傷口處皮膚進(jìn)行病理學(xué)切片染色，H&E、Masson、IL-6、CD31染色表明，5% GL MN貼片具有良好的促進(jìn)傷口愈合、減少炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成的作用。

圖9 不同治療后的組織再生、炎癥反應(yīng)和血管生成

綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種新型且生物相容性良好的益生菌微針貼片，具有長(zhǎng)效抗菌作用，可促進(jìn)感染傷口的愈合。微針貼片為益生菌提供了良好的保護(hù)，在4℃下，它在微針貼片內(nèi)保持高達(dá)80%的活力超過(guò)60天。插入皮膚后，微針貼片迅速溶解并實(shí)現(xiàn)益生菌在深層傷口組織中的快速遞送，益生菌能夠在傷口中存活約一周，并不斷將共同遞送的甘油轉(zhuǎn)化為抗菌物質(zhì)，從而在感染的傷口中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抗菌作用。在金黃色葡萄球菌感染傷口的小鼠模型中，與對(duì)照組相比，一次施用益生菌微針貼劑在消除有害細(xì)菌和促進(jìn)傷口閉合方面表現(xiàn)出更好的效果，同時(shí)減少炎癥、增強(qiáng)組織再生和血管生成，這對(duì)慢性感染傷口的治療具有巨大潛力。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.05.008