1.“合成生物”是什么?
合成生物其實(shí)就是一種“造物”的技術(shù)。它融合了生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)等多種技術(shù),以可再生生物質(zhì)為原料,以生物體作為生產(chǎn)介質(zhì),旨在利用廉價(jià)原料,以菌群、細(xì)胞和酶為制造工廠,規(guī)?;l(fā)酵獲得目標(biāo)產(chǎn)品,具有清潔、高效和可再生等特點(diǎn)。
以透明質(zhì)酸(玻尿酸)為例。最初,透明質(zhì)酸取自牛的眼睛,價(jià)格非常昂貴。但通過(guò)生物合成技術(shù),相較于傳統(tǒng)的化學(xué)技術(shù),既安全環(huán)保,成本又低,真正實(shí)現(xiàn)了科技改變生活。合成生物學(xué),蘊(yùn)含著“一切皆可合成”的潛能,隱藏著解鎖新質(zhì)生產(chǎn)力的密碼,也是目前從海外到國(guó)內(nèi)最火的未來(lái)產(chǎn)業(yè)新賽道之一。如江南大學(xué)團(tuán)隊(duì)利用合成生物學(xué)技術(shù),借助微生物發(fā)酵生產(chǎn)普通分子量的透明質(zhì)酸,把成本降到每公斤幾百元,實(shí)現(xiàn)了透明質(zhì)酸大產(chǎn)量推廣應(yīng)用。團(tuán)隊(duì)通過(guò)人工合成方法,對(duì)現(xiàn)有的、天然存在的生物系統(tǒng)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和改造,甚至創(chuàng)造出自然界不存在的“生物結(jié)構(gòu)”,大大提高了產(chǎn)量。
2.合成生物學(xué)表型測(cè)試生物反應(yīng)器有哪些?
合成生物學(xué)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展,形成了典型的細(xì)胞工廠創(chuàng)制“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”(design-build-testlearn, DBTL) 循環(huán),成為支撐面向加速生物制造發(fā)展的智慧生物育種的重要方法。其中,測(cè)試環(huán)節(jié)是對(duì)前期所設(shè)計(jì)與構(gòu)建的生物體系進(jìn)行表型測(cè)試,以提供大量數(shù)據(jù)用于后續(xù)的學(xué)習(xí)和迭代升級(jí)。測(cè)試階段的通量主要依賴(lài)于細(xì)胞自身或其培養(yǎng)測(cè)試所使用的生物反應(yīng)器及其裝備,是整個(gè)DBTL流程的限速步驟。本文系統(tǒng)綜述了合成生物學(xué)表型測(cè)試所開(kāi)發(fā)的面向不同通量的生物反應(yīng)器及裝備,從單細(xì)胞檢測(cè)和篩選及不同尺度生物反應(yīng)器包括皮納升級(jí)生物反應(yīng)器、微升級(jí)生物反應(yīng)器、毫升級(jí)生物反應(yīng)器和升級(jí)生物反應(yīng)器等。
在DBTL循環(huán)的表型測(cè)試環(huán)節(jié)中,針對(duì)不同應(yīng)用目標(biāo)和不同通量需求的測(cè)試,生物反應(yīng)器成為主要的表型研究工具,比如單細(xì)胞檢測(cè)篩選技術(shù)、基于多孔板的高通量篩選技術(shù)以及基于微流控的高通量篩選技術(shù)。
1)單細(xì)胞分選法
單細(xì)胞篩選是指根據(jù)細(xì)胞自身的特征,如細(xì)胞的形狀、密度、大小、光信號(hào)、圖像特征等進(jìn)行篩選。單細(xì)胞懸滴法則是根據(jù)液滴重力或微泵將包含單個(gè)細(xì)胞的液滴分配到目標(biāo)基板(如微孔板)上,而非目標(biāo)液滴則被轉(zhuǎn)移至廢液收集瓶中,分選過(guò)程溫和,但速度受限。此外,近年來(lái)有許多研究在微流控芯片上設(shè)計(jì)了許多微結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或粒子的主動(dòng)分選,包括微井結(jié)構(gòu)陣列單細(xì)胞捕獲、確定性橫向位移 (deterministic lateral displacement, DLD)和慣性流系統(tǒng)(inertial microfluidic),可基于單個(gè)細(xì)胞的直徑大小和彈性對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行快速高通量分選,且無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞分離。
圖1單細(xì)胞檢測(cè)與分選裝置工作原理圖
2)皮納升級(jí)微型生物反應(yīng)器
皮納升級(jí)生物反應(yīng)器體積范圍 1 pL~100 nL,主要包括兩種類(lèi)型:一種是采用微加工技術(shù)在基板上制作微孔陣列,微孔直徑常小于500 μm,細(xì)胞裝入微孔中進(jìn)行培養(yǎng)和檢測(cè),基于
微孔的單細(xì)胞篩選的通量約為102~103個(gè);另一種是基于微液滴的生物反應(yīng)器,它是由液滴微流控技術(shù)產(chǎn)生的,將細(xì)胞封裝在液滴中進(jìn)行培養(yǎng)和檢測(cè),液滴直徑常小于 200 μm,基于微液滴的單細(xì)胞篩選技術(shù)的通量為105~108個(gè)。這些皮納升規(guī)模的生物反應(yīng)器相對(duì)于大型生物反應(yīng)器可以有效提高細(xì)胞生長(zhǎng)的初始濃度,為單細(xì)胞提供非競(jìng)爭(zhēng)性的生長(zhǎng)空間 ,更有利于細(xì) 胞的生長(zhǎng)和代謝。
液滴微流控是指通過(guò)油相和水相在微流控芯片中進(jìn)行相互剪切,形成大規(guī)模的均勻液滴群,這些液滴直徑常小于 300 μm,在微生物學(xué)高通量單細(xì)胞培養(yǎng)和分析方面已顯示出其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。微液滴具有通量高、體積小、易操作、傳質(zhì)傳熱迅速等特點(diǎn),已日益成為單細(xì)胞分析的重要工具,其應(yīng)用包括聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、細(xì)胞培養(yǎng)、分選、分離、克隆形成、細(xì)胞裂解、基因和蛋白質(zhì)表達(dá)、抗體分泌以及細(xì)胞毒性分析研究。在微生物學(xué)領(lǐng)域,液滴通常是指油包水(Water-in-Oil, W/O)結(jié)構(gòu)的微液滴,可以很容易地通過(guò)主動(dòng)和被動(dòng)的液滴生成技術(shù)制備。單細(xì)胞培養(yǎng)的液滴大小從皮升到納升不等,由于細(xì)胞在生成液滴過(guò)程中是隨機(jī)分配到液滴內(nèi)的,被包裹在液滴中的細(xì)胞數(shù)量及其分布概率服從泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律,這與有限稀釋方法類(lèi)似。為了提高單細(xì)胞包封率,研究人員利用慣性流體技術(shù)或介電泳技術(shù)對(duì)芯片上液滴生成單元上游的細(xì)胞進(jìn)行排序,并控制其逐一進(jìn)入液滴,使得單細(xì)胞包封率可提高至 80% 以上。液滴形成后,可將液滴群儲(chǔ)存在小容器中,如離心管、微管或其他自制容器中,然后放置在合適的溫度、濕度和氣體環(huán)境中進(jìn)行孵育,微生物可在液滴中進(jìn)行增殖和代謝??紤]到不同微生物種類(lèi)需要不同的氧氣濃度,研究人員采用高透氣性微管路來(lái)儲(chǔ)存液滴,氧氣和二氧化碳可以通過(guò)管壁不斷滲透到油相中,或者對(duì)油相進(jìn)行反復(fù)充氧,使其給液滴供氧。
液滴的檢測(cè)與流式細(xì)胞術(shù)類(lèi)似,其檢測(cè)信號(hào)包括熒光、拉曼、圖像、光散射、阻抗、核磁、電化學(xué)、質(zhì)譜和光吸收度等。對(duì)于液滴分選,與單細(xì)胞分選方式類(lèi)似,仍然可以利用電場(chǎng)、磁場(chǎng)、光場(chǎng)、聲場(chǎng)、重力場(chǎng)、流體動(dòng)力場(chǎng)所產(chǎn)生的力來(lái)驅(qū)動(dòng)液滴到收集或廢液通道。通過(guò)上述檢測(cè)方式和分選方式的組合集成,可以實(shí)現(xiàn)高通量、高效率的微生物檢測(cè)與篩選。在皮納升微液滴反應(yīng)器中,較為廣泛使用的裝置是熒光激活液滴分選系統(tǒng)(fluorescence activated droplet sorting,F(xiàn)ADS)。其是將液滴熒光檢測(cè)和介電泳分選方式進(jìn)行集成設(shè)計(jì),檢測(cè)到液滴熒光信號(hào)后,如果是感興趣的目標(biāo)液滴,則在微流控芯片下游用介電泳所產(chǎn)生
的驅(qū)動(dòng)力推動(dòng)至收集通道中,完成液滴的檢測(cè)分選,該技術(shù)平臺(tái)在微生物高通量篩選和酶進(jìn)化領(lǐng)域已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用,有較多的相關(guān)文獻(xiàn)綜述報(bào)道。
圖2基于皮納升微液滴的單細(xì)胞表型測(cè)試與篩選
3.微流控技術(shù)在合成生物學(xué)的應(yīng)用前景展望
液滴微流控技術(shù)具有操作容易、通量高、液滴培養(yǎng)數(shù)字化和易自動(dòng)化等特點(diǎn),是適于合成生物學(xué)高通量表型測(cè)試的頗具廣泛應(yīng)用前景的方法。商業(yè)化的裝備系統(tǒng)體積小、運(yùn)行成本低、使用和維護(hù)方便,越來(lái)越受到廣大科研人員和工程技術(shù)人員的關(guān)注,成為合成生物學(xué)發(fā)展的智慧平臺(tái)。目前,液滴微流控技術(shù)仍處于產(chǎn)業(yè)化上升期,雖然已有部分技術(shù)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化推廣,但如何進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)微液滴的高度穩(wěn)定、提升液滴通量的精準(zhǔn)可控性、實(shí)現(xiàn)微液滴裝備的創(chuàng)新定制化以及液滴操作的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化等方面仍然存在大量的基礎(chǔ)科學(xué)和工程科學(xué)問(wèn)題需要深入研究。另外,需要發(fā)展更多適用于不同尺度液滴體系的表型測(cè)試傳感器,顯著提升表型表征能力,構(gòu)建更多維度的基因型-表型模型,為液滴微流控技術(shù)在DBTL循環(huán)中的應(yīng)用提供更強(qiáng)大的使能工具,最終實(shí)現(xiàn)開(kāi)發(fā)國(guó)產(chǎn)替代高通量自動(dòng)化合成生物設(shè)施平臺(tái),突破我國(guó)生物技術(shù)裝備研發(fā)能力弱、自主創(chuàng)新設(shè)備欠缺等“卡脖子”問(wèn)題,加速我國(guó)合成生物技術(shù)原始創(chuàng)新步伐,支撐綠色生物經(jīng)濟(jì)的高質(zhì)量發(fā)展。
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審核編輯 黃宇
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微流控芯片
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