磁場控制技術(shù)在微流控系統(tǒng)中的應(yīng)用案例

微流控技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)在包括細(xì)胞操控分析、醫(yī)學(xué)診斷、生物學(xué)研究等多個領(lǐng)域顯示了較好的應(yīng)用前景。作為在微米尺度結(jié)構(gòu)中操控流體的驅(qū)動力，磁場具有電場和流體動力所不具備的優(yōu)勢。磁場力的大小不受通道表面電荷、溶液pH值、離子強(qiáng)度和溫度等條件的限制，而且磁場可以不與通道內(nèi)的物質(zhì)直接接觸而實現(xiàn)控制，極大降低了交叉污染的可能。由于磁性粒子與周圍介質(zhì)之間的磁化率有很大差別，因此，利用磁場可以將其方便地與周圍介質(zhì)分離，這一特性使其在微流控芯片分離富集方面的優(yōu)勢顯得尤為突出。隨著微電子機(jī)械系統(tǒng)(micro electromechanical system， MEMS)技術(shù)的進(jìn)步，在微流控芯片中加工微尺度甚至陣列電磁線圈和磁體成為可能，因此，磁場控制技術(shù)在微流控系統(tǒng)中具有非常廣闊的應(yīng)用空間。該技術(shù)在近兩年發(fā)展非常迅速，尤其在免疫分析、病原體檢測和分子診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用獨具優(yōu)勢，在本文中，我們將對這一領(lǐng)域的最新進(jìn)展做一介紹。加工技術(shù)微流控芯片系統(tǒng)中的磁場控制一般通過外加磁場、加工集成永磁體或電磁體等方式對微通道中磁性粒子進(jìn)行有效操縱來實現(xiàn)。磁性粒子所受到的磁場力可以用式表示：

其中，Δχ是磁性粒子與周圍溶液或介質(zhì)的磁化率差，V是粒子的體積，μ0為真空磁導(dǎo)率， B 是磁感應(yīng)強(qiáng)度，?B 為磁場梯度。對于均勻磁場來說，?B為0，此時，粒子在磁場中只能被磁化，而不會受力發(fā)生移動。

所以，磁性粒子只有在不均勻的磁場中才能夠發(fā)生受力運動，而磁感應(yīng)強(qiáng)度B 在磁場方向隨距離增加是呈指數(shù)遞減的。因此，通常為了對微通道中的磁性粒子進(jìn)行精確地操縱和定位，需要磁場盡量接近微通道。

無論永磁體還是電磁體，通過提高磁感應(yīng)強(qiáng)度來得到最大磁場力的努力總是受到材料和現(xiàn)有技術(shù)水平的限制，一個簡單有效的辦法就是縮小磁場區(qū)域，即提高磁場梯度?B。

對于微流控芯片來說，磁場的尺寸和形狀要盡量與微米級的芯片通道相匹配，于是，基于MEMS技術(shù)的集成磁控器件的加工技術(shù)一直備受關(guān)注。在芯片上加工電磁線圈一般都需要經(jīng)過多次光刻和電鍍程序。

圖顯示了一種電磁線圈的加工過程，采用光刻技術(shù)在玻璃表面制作出金屬線圈、導(dǎo)線和絕緣層等微結(jié)構(gòu)單元，控制每層金屬薄膜的尺寸和形狀，一般在電鍍之前均要沉積一層金屬作為種子層，金屬層之間通過SU28光膠或聚酰亞胺進(jìn)行絕緣。

Ra2madan等還發(fā)現(xiàn)，在電磁線圈中間加工軟鐵芯，可以大大提高磁場梯度，有利于對磁性粒子的操控，與單純電磁線圈相比，磁場力可提高20倍。

集成磁體的微流控系統(tǒng)可以得到微型化的精準(zhǔn)磁場，但是加工工藝過于復(fù)雜，不易實現(xiàn)。

針對這一問題，Whitesides等報道了一種在聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane， PDMS)芯片中加工微米級電磁體的簡單方法，即采用軟光刻方法先在PDMS芯片中加工出微通道，然后灌注液體焊錫，冷卻通電即可產(chǎn)生必要的電磁場。

Lin等采用類似方法在側(cè)通道中充入并固定金屬鎳的磁性微球，在與其僅距25μm的分離通道中形成較強(qiáng)的磁場梯度，實現(xiàn)對磁珠的分離。

此外，與芯片集成化磁體相比，采用施加外加磁場的方法通?？梢缘玫酵瑯佑行У拇艌鲎饔茫?，具有易于加工和低成本的優(yōu)勢，因此，這類方法在磁控微流控系統(tǒng)中的應(yīng)用非常廣泛。

流體控制泵閥

通過泵閥來控制流體是除了分離外，磁場在微流控芯片系統(tǒng)中的另一個主要功能，其中泵主要有磁流體動力(magnetohydrodynamic， MHD)泵，鐵磁流體( ferrofluidic)泵和蠕動泵等。

MHD泵是利用施加正交的磁場和電場產(chǎn)生的洛倫茲力來驅(qū)動液流，適用于任何導(dǎo)電的液體，是較早使用的一種磁驅(qū)動模式。但MHD泵在工作時溶液經(jīng)常會因電解而產(chǎn)生氣泡，影響正常的驅(qū)動和分析操作。

Arumugam等通過在溶液中加入氧化還原劑，減少了氣泡的產(chǎn)生，并延長了電極的使用壽命，而且這種泵需要的電壓比普通直流MHD泵低，水性和非水性的溶液都可以被驅(qū)動。

與MHD 泵相比，鐵磁流體驅(qū)動只需施加磁場而不需電場，因此系統(tǒng)更加簡單。鐵磁流體是磁性粒子在水溶液或者有機(jī)溶液中形成的穩(wěn)定懸濁液，同時具有磁性和流動性。

其中，鐵磁流體溶液與所運輸溶液必須是不互溶的，因此，當(dāng)輸運對象為水溶液時，磁性粒子必須分散在油性溶液中，而微通道表面親疏水性質(zhì)也會在很大程度上影響鐵磁流體泵的性能。

Yobas等還設(shè)計了一種旋轉(zhuǎn)的磁控芯片系統(tǒng)，利用磁場帶動不銹鋼滾珠在軌道上滾動擠壓PDMS通道，巧妙地實現(xiàn)了蠕動泵的驅(qū)動功能。

此外，還有阻抗泵、氣體泵、微齒輪泵以及利用集成二極管與交變電場相互作用來實現(xiàn)驅(qū)動的磁微流體裝置等。

對于流體動力驅(qū)動的微流控芯片系統(tǒng)來說，加工有效的微閥結(jié)構(gòu)也是至關(guān)重要的，除了Quake課題組早年提出的氣動閥外，利用磁場控制微通道的閉合和開啟也可以方便地進(jìn)行試劑/樣品的切換，實現(xiàn)閥的功能，結(jié)構(gòu)更為簡單靈活。混合

微米尺度條件下流體通常是層流狀態(tài)，因此，在微通道中如何進(jìn)行有效混合一直是科學(xué)工作者們感興趣的課題。

解決的方法之一就是通過MEMS加工技術(shù)將磁子安置在微通道內(nèi)，利用磁場帶動磁子轉(zhuǎn)動以達(dá)到高效混合的目的。

但是，三維加工技術(shù)難度較大，不利于普及應(yīng)用。Nallani等報道了一種傾斜曝光方法，用于加工三維的鐵磁性微轉(zhuǎn)子。

他們利用空氣和SU28折射率不同，讓紫外光以55°角入射，得到傾斜角為31.6°的SU28模具。

然后將鐵鎳合金注入制成具有三維結(jié)構(gòu)的磁性轉(zhuǎn)子，該轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動時可引起液流的三維擾動，實現(xiàn)微尺度下的快速混合。

與加工磁子相比，利用磁珠的運動形成不規(guī)則流體是一種簡單有效的進(jìn)行混合的方法。

Hu等通過改變外加磁場頻率使液滴中的磁珠擾動并形成不同形式的渦流，從而實現(xiàn)液滴的快速高效混合。

Oh等則利用側(cè)通道中一段鐵磁流塞的往復(fù)運動誘導(dǎo)主通道中流體產(chǎn)生擾動，來進(jìn)行有效地混合。

操控磁珠/細(xì)胞的操縱在微流控芯片系統(tǒng)中對細(xì)胞或體積更小的病毒顆粒甚至單分子進(jìn)行精確地操縱一直是科學(xué)家們競相研究的熱點，磁控芯片系統(tǒng)可以方便地通過磁珠捕獲目標(biāo)分子，再利用磁場進(jìn)行精確控制。

為了降低電磁場所需電流并形成有效的磁場梯度，Wang等在芯片上制作了4條銅導(dǎo)線，并將整個芯片置于永磁鐵上，通過控制銅線電流可以選擇性地操控單個磁珠。

Latham等則通過外加磁場實現(xiàn)納米磁珠在雙層正交微通道間的連續(xù)切換進(jìn)樣，進(jìn)樣量和速度均可控制。

一些細(xì)胞具有天然的磁性，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞等，因此利用磁控芯片系統(tǒng)可直接對其進(jìn)行操縱。Krichevsky等將磁帶的磁頭進(jìn)行改進(jìn)，利用其在空間產(chǎn)生的高梯度磁場來捕獲和分選磁性細(xì)菌，并利用內(nèi)置的自旋閥傳感器進(jìn)行檢測。

對于大部分本身不具有磁性的細(xì)胞，可以將其吸附到功能化的磁珠表面后進(jìn)行操控。Koschwanez等在PDMS芯片上直接沉積錐形結(jié)構(gòu)的鎳鈷硼合金，在外界小型永磁體的作用下磁化，可捕獲單個酵母細(xì)胞。

Lee等在微流控芯片上加工由一系列微線圈構(gòu)成的集成電路，可快速調(diào)整磁場強(qiáng)度和模式，同時控制多個細(xì)胞。此外， Chiou等還利用微流控芯片集成電磁線圈實現(xiàn)對單個DNA分子的拉伸和旋轉(zhuǎn)等操作。

液滴的操控

近年來發(fā)展起來的微液滴技術(shù)具有樣品消耗少、低污染、混合快等優(yōu)點，是一種理想的微反應(yīng)器。

利用磁場可以在油相或超疏水的表面操控含有磁性物質(zhì)的液滴，通過施加外磁場可以方便地控制液滴移動，依次完成運輸、混合、反應(yīng)及在不同溫區(qū)間往復(fù)移動等操作。

Lehmann等利用印刷電路板(p rinted circuit board，PCB)加工成微線圈，如圖所示，他們在微線圈上面涂覆一層局部親水的疏水Teflon膜，于是可以在Teflon表面形成固定位點的水溶液滴，這些液滴分別含有細(xì)胞裂解液、雜交液和洗脫液等成分。

接著，通過二維磁場控制含有磁性微球的液滴依次經(jīng)過這些液滴，完成吸附、清洗和洗脫等步驟，實現(xiàn)核酸提取和酶反應(yīng)等操作。

Wang等利用磁場和電潤濕作用對液滴中的磁珠進(jìn)行富集和分離，效率可以達(dá)到90%以上。Haguet等甚至可以對懸浮液滴進(jìn)行操縱，含有反磁性物質(zhì)的液滴在永磁體微槽中，可以懸浮在空氣中，并沿著軸向，在垂直交叉的槽內(nèi)移動。

利用磁場對液滴進(jìn)行操控具有選擇性強(qiáng)、方便靈活等特點，因此，這一方法可能成為微液滴操縱的一個有效的手段，而高集成度的微電磁線圈陣列則可能成為構(gòu)建高通量微液滴反應(yīng)器的基本平臺。

磁分離磁珠/細(xì)胞分離

使磁場與微通道的距離盡量縮短以及形成盡可能大的磁場梯度是得到足夠磁場力對粒子進(jìn)行操控的最有效手段，因此，對于外加磁場的微流控系統(tǒng)來說，通常需要將磁體集成到芯片上，以盡可能接近微分離通道。

芯片集成電磁線圈通常由于功率限制不能夠施加很高的電流，磁力比較弱，有時還需要外加磁場的輔助。

針對上述問題， Xia等在芯片主通道一側(cè)電鍍NiFe層，可產(chǎn)生高梯度磁場，該芯片通道為Y型，當(dāng)磁珠標(biāo)記的細(xì)胞從離磁場較遠(yuǎn)處的進(jìn)口引入時，細(xì)胞就會由于磁場作用而偏離原來的方向，從另一個出口流出，得到有效的分離。

Kim等和Shih等也采用了類似的芯片設(shè)計，分別用于分離凋亡T淋巴細(xì)胞和病毒顆粒。

Liu等通過精確控制磁場的頻率，對不同直徑的磁珠進(jìn)行了分離。Qu等則利用紅細(xì)胞和白細(xì)胞本身的順磁性和反磁性，分離了全血中的這兩種細(xì)胞。

核酸提取

利用磁性微球表面修飾特定的功能化基團(tuán)分離核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得相當(dāng)成熟，并得到了非常廣泛的應(yīng)用。

因此，這一技術(shù)也被諸多課題組用于微流控芯片中提取微量核酸樣品。微流控芯片上進(jìn)行DNA提取一般先將細(xì)胞破膜，釋放出的DNA被吸附在功能化的磁珠表面，再利用外界磁場將磁珠固定，細(xì)胞膜及其他物質(zhì)都被清洗液沖走，最后將DNA洗脫進(jìn)行PCR 擴(kuò)增等操作。

Lee等設(shè)計了簡單的單通道芯片結(jié)構(gòu)，使用808nm激光束使細(xì)胞快速破膜，然后用磁珠捕獲了包括E. coli在內(nèi)的幾種病原體。此后，他們還設(shè)計了集成化的病原體檢測芯片，在CD 光盤上僅用12 min即完成了全血中特異病原體基因的提取。

Nakagawa等使用改性的細(xì)菌磁性微球提取全血中的DNA， 5μl的全血可以提取165 ng DNA，洗脫約100 ng，萃取效率為60.6%。

Dubus等利用磁珠連接的探針與目標(biāo)DNA配對成雙鏈，再利用一種富含正電荷的熒光高聚物與雙鏈DNA發(fā)生靜電作用，從而對目標(biāo)DNA進(jìn)行了分離和高靈敏度檢測，檢出限可以達(dá)到200拷貝/150μl，與采用PCR擴(kuò)增方法的水平接近。

利用微流控芯片進(jìn)行核酸提取，需要的細(xì)胞數(shù)量較少，而且降低了污染，有利于對稀有細(xì)胞進(jìn)行分選和分析。應(yīng)用

如前所述，表面功能化的磁珠作為固相載體，可以用來有效地捕獲核酸、蛋白分子、病毒顆粒甚至細(xì)胞，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種生化指標(biāo)的臨床診斷等領(lǐng)域。

而微流控芯片系統(tǒng)具有快速、高效、集成化等特點，兩者結(jié)合，有望實現(xiàn)臨床檢測儀器進(jìn)一步便攜化和微型化，甚至將臨床診斷技術(shù)帶入現(xiàn)場診斷(point-of-care testing， POCT)的時代。

免疫分析

免疫分析是臨床上常用的檢測方法，磁控免疫芯片系統(tǒng)一般采用非均相免疫體系，以包被了抗體或抗原的微米或納米磁珠為載體，在微通道中固定這些磁珠以捕獲抗原或抗體。

采用微流控芯片系統(tǒng)顯著改善了常規(guī)免疫分析的速度和性能，大大降低了成本和試劑的消耗，一些系統(tǒng)在POCT領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景。

磁控免疫芯片的檢測系統(tǒng)也從激光誘導(dǎo)熒光檢測發(fā)展到電化學(xué)傳感器，無需進(jìn)行熒光標(biāo)記，系統(tǒng)體積可進(jìn)一步減小，有利于實現(xiàn)便攜化。

此外， Herrmann等設(shè)計了雙通道芯片網(wǎng)絡(luò)，免疫復(fù)合物形成與酶反應(yīng)在不同通道中進(jìn)行，減少了非特異性吸附，降低了背景噪聲，從而將檢測限降低到100 pg/ml水平。

Morozov等則將電場和磁場相結(jié)合，來提高系統(tǒng)靈敏度。他們首先利用電泳，使得溶液中的抗原與固定在通道側(cè)壁的抗體充分結(jié)合，再加入表面功能化的磁珠與抗原結(jié)合，利用光學(xué)顯微鏡檢測，最低可以檢測到10^-17 mol/L的鏈霉親和素。

實現(xiàn)生化分析的現(xiàn)場化和高通量一直是臨床檢測的發(fā)展目標(biāo)， Tang等設(shè)計了4種不同抗體的電極，可以同時測定甲胎蛋白(AFP)等4種腫瘤標(biāo)志物。

Lacharme等則通過降低磁場偶極能量使得磁珠在微通道中進(jìn)行自組裝，形成有序的陣列結(jié)構(gòu)，以進(jìn)行免疫分析。

病原體檢測與免疫分析芯片一樣，便攜式高通量病原體檢測芯片將成為未來應(yīng)付大規(guī)模突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的有力工具之一。Pipper等設(shè)計了通過磁場操縱液滴來完成捕獲、釋放、混合、反應(yīng)、檢測等步驟，對高致病H5N1禽流感病毒進(jìn)行了實時定量RT-PCR檢測，與傳統(tǒng)方法相比靈敏度提高4倍，成本降低至少20倍。Lee等設(shè)計了一系列集成磁控芯片系統(tǒng)，通過連接在磁珠上的抗體識別并捕獲病毒分子，釋放其中RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，完成對登革熱病原體的離線檢測。蛋白組學(xué)

磁控微流控芯片的另一個應(yīng)用是用于蛋白質(zhì)的高效酶解。用包被有褐藻酸的磁珠固定胰蛋白酶，在芯片上消化蛋白質(zhì)，可獲得很高的效率，Viovy課題組在這方面做了一系列研究工作。

他們在微通道的兩側(cè)放置磁鐵，與通道呈30°夾角，使磁力線方向與液流方向平行，表面固定胰蛋白酶的磁珠引入后在磁場作用下會在通道內(nèi)自組裝成填充柱結(jié)構(gòu)，隨后引入樣品進(jìn)行酶解。

此外， Li等建立了利用功能化磁珠固定胰蛋白酶的芯片酶反應(yīng)器-MALD I-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)，為更加深入的蛋白組學(xué)研究提供了有力的工具。

核磁共振

核磁共振(NMR)是進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)鑒定的有效工具之一，近年來微型核磁線圈探頭的發(fā)展使得NMR檢測的靈敏度又有了顯著的提高。

Lin等提出一種基于微液滴的NMR檢測技術(shù)，采用納升級分流器可以收集98%的液相色譜儀流分用于NMR檢測，而另外2%用于質(zhì)譜分析，與常規(guī)系統(tǒng)相比靈敏度和進(jìn)樣效率均有大幅提高。

通過合理設(shè)計，微流控芯片還可以作為化學(xué)反應(yīng)過程分析的理想工具。Takahashi等設(shè)計了微流控芯片NMR檢測系統(tǒng)的接口，可以方便地用于實時監(jiān)控化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物。

Pines等將遠(yuǎn)程NMR檢測方法用于監(jiān)控非平衡化學(xué)反應(yīng)過程中反應(yīng)單體與產(chǎn)物之間的自旋相干轉(zhuǎn)移，可以給出更多有關(guān)反應(yīng)機(jī)理的信息。

隨后，他們將原子磁力計集成到微流控芯片上，并在零磁場區(qū)域進(jìn)行NMR檢測，檢測器外無需安置螺線管，樣品與檢測器更加接近，靈敏度顯著提高。

值得一提的是，不久前Lee等報道了一套完全微型化的NMR芯片系統(tǒng)，包括陣列微流控芯片、集成線圈、NMR電路和經(jīng)過簡化的微型永磁體，整個裝置可以放進(jìn)上衣口袋。

該系統(tǒng)可以同時檢測5-10 μl樣品中的8種指標(biāo)，并被成功用于病毒、細(xì)胞和疾病標(biāo)志物的檢測。

綜上所述，磁場控制技術(shù)應(yīng)用到微流控系統(tǒng)中為后者開辟了更為廣泛的發(fā)展空間，提高了微流控系統(tǒng)對各種物質(zhì)進(jìn)行操控的能力，甚至可以實現(xiàn)單細(xì)胞或單分子的捕獲和控制，同時，也提高了系統(tǒng)的集成化程度。

磁場控制技術(shù)在微流控芯片系統(tǒng)中的應(yīng)用將會在以下幾個方向有更廣闊的發(fā)展前景。

首先，磁場所具有的獨特分離能力已經(jīng)在傳統(tǒng)樣品處理過程中顯示了強(qiáng)大的優(yōu)勢，與微流控芯片技術(shù)的結(jié)合，使得整個系統(tǒng)可以處理更少的樣品量，對于稀有標(biāo)本或臨床檢測具有重要意義;

其次，微型化的電磁線圈對于單個細(xì)胞甚至分子具有更高的分辨能力，可以進(jìn)行單細(xì)胞或亞細(xì)胞器的分離、提純及其分析;

目前，磁珠表面功能化技術(shù)日臻成熟，將其應(yīng)用于微流控芯片技術(shù)中，通過在各個微結(jié)構(gòu)中固定具有不同基團(tuán)的磁珠，可實現(xiàn)快速、集成、高通量的樣品處理、分離及檢測分析等。

當(dāng)前，磁場控制微流控芯片系統(tǒng)也面臨一些亟待解決的問題：

(1)如何通過集成電磁線圈程序化地控制磁珠精確定位和移動方向及速度，還有待深入研究；

(2)現(xiàn)有的磁控微流控芯片對樣本的處理通量仍然較低，不能夠滿足大規(guī)模臨床檢測的需求，因此如何提高芯片單次處理樣本的數(shù)量也是將來努力的方向；

( 3)如何改善現(xiàn)有集成電磁線圈加工工藝，制作具有更高磁場梯度和強(qiáng)度的微磁體，加強(qiáng)工藝標(biāo)準(zhǔn)化和系統(tǒng)穩(wěn)定性的問題，對未來的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展也具有重要的意義。

總而言之，對于多數(shù)系統(tǒng)來講，微型化、自動化和高通量仍然是將來發(fā)展的一個重要方向，生物分析包括臨床診斷和現(xiàn)場檢測將成為磁控微流控系統(tǒng)發(fā)展的重要突破;此外，在蛋白組學(xué)、細(xì)胞分析等領(lǐng)域也將有較大的發(fā)展前景。