雙光子顯微成像激光調(diào)制解決方案

圖 1： 橫向普克爾斯盒操作的簡(jiǎn)化表示。 通過調(diào)整施加的電場(chǎng)調(diào)制透過分析儀的透射率。

自從雙光子激光掃描熒光顯微鏡方面的開創(chuàng)性著作(登克等人，1990 年)于 1990 年發(fā)表以來，該技術(shù)已經(jīng)從激光技術(shù)的巨變中受益。 這些改進(jìn)進(jìn)一步推動(dòng)了這種最初從物理實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)的技術(shù)向細(xì)胞生物學(xué)、疾病研究和高級(jí)神經(jīng)科學(xué)成像領(lǐng)域的滲透。

一體式可調(diào)諧鈦寶石激光器在 2001 年左右開始了這一趨勢(shì)。幾年后，激光器中增加了自動(dòng)色散控制功能，以優(yōu)化顯微鏡樣品平面的脈沖持續(xù)時(shí)間。 隨著在超過鈦寶石激光器上限的波長(zhǎng)下可激發(fā)的探測(cè)脈沖變得更加成熟和高效，2010 年之后，激光器公司轉(zhuǎn)向了光學(xué)參量振蕩器來滿足對(duì)多顏色維度、更深成像和更少光損傷的需求。

在本文中，我們將討論這一演變的下一階段，即快速功率調(diào)制在激光系統(tǒng)中的集成，并討論這個(gè)階段將如何實(shí)現(xiàn)更快的設(shè)置時(shí)間、比較高的性能和更低的擁有成本。

雙光子顯微成像中的激光功率控制要求。

在最簡(jiǎn)單的顯微鏡中，可以通過添加相位延遲波片和偏振分析儀來實(shí)現(xiàn)對(duì)激光功率的連續(xù)控制。 通過旋轉(zhuǎn)波片，激光功率透過分析儀的透射率通?？梢詮?0.2% 透射率變?yōu)?99% 左右。 例如，通過電動(dòng)旋轉(zhuǎn)波片，該過程可以自動(dòng)改變顯微鏡中成像平面的功率，以均衡不同深度幀處的聚焦積分通量。

圖 2： 雙光子顯微鏡上的典型普克爾斯盒部署。 EOM 位于用戶右下方。 英國(guó)牛津大學(xué) Packer 實(shí)驗(yàn)室提供照片。

不過，大多數(shù)現(xiàn)代激光掃描雙光子顯微鏡都需要更快的調(diào)制速度。 例如，對(duì)于僅應(yīng)在單個(gè)方向上進(jìn)行數(shù)據(jù)采集的光柵激光掃描應(yīng)用，在“反激操作”期間必須消隱激光以避免不必要的熒光激發(fā)或光漂白。 如果是共振振鏡掃描儀，得到的上升/下降時(shí)間可能短至幾微秒。 在這一領(lǐng)域，必須考慮光調(diào)制方法。

電光調(diào)制

電光調(diào)制器 (EOM) 利用普克爾斯效應(yīng)，通過對(duì)光束施加相位延遲來調(diào)制激光功率。 在電光調(diào)制器中，通過施加電場(chǎng)，在非中心對(duì)稱的晶體中誘發(fā)雙折射。 和以前一樣，使用偏振分析儀來完成調(diào)制器設(shè)置。

可以在縱向激發(fā)幾何結(jié)構(gòu)中配置普克爾斯盒，以適應(yīng)具有相對(duì)較短晶體的較大光束。 在這種情況下，典型的 1?2 波電壓(即偏振旋轉(zhuǎn) 90 度所需的電壓)約為 6 kV，這在 2P 顯微鏡所需的速度和占空比下難以實(shí)現(xiàn)。 因此，大多數(shù)成像配置采用橫向電場(chǎng)幾何結(jié)構(gòu)，使用更長(zhǎng)的晶體，這會(huì)顯著降低半波電壓。 晶體通常采用 2 種或更多種串行配置進(jìn)行部署，彼此相對(duì)旋轉(zhuǎn)，以進(jìn)一步降低所需的開關(guān)電壓并補(bǔ)償熱負(fù)載效應(yīng)。

圖 3： Chameleon Discovery NX TPC 和調(diào)制后的典型最大輸出功率

必須注意通過晶體校準(zhǔn)和偏移(偏置)電壓調(diào)整來優(yōu)化脈沖對(duì)比度(最小與最大發(fā)射功率的比率)以獲得優(yōu)異的圖像對(duì)比度。

普克爾斯盒在雙光子顯微成像中得到了廣泛采用，在“自制者”社區(qū)中尤為明顯，因?yàn)槠洳渴鹣鄬?duì)簡(jiǎn)單，特別是對(duì)于只需要在常用雙光子波長(zhǎng)下使用適度功率的用戶。

例如，基于磷酸二氘鉀 (KD*P) 的盒可為高達(dá)約 1100nm 的 2P 應(yīng)用提供出色的透射率、速度和對(duì)比度特性，并可提供適中的激光功率。 此外，KD*P 具有很低的群速度色散特性，從而顯著減小群延遲色散 (GDD)。 為此，在使用沒有色散預(yù)補(bǔ)償和有限調(diào)諧的超快激光器時(shí)(例如鈦寶石激光器)，KD*P 普克爾斯盒是一種熱門選擇。

聲光調(diào)制

聲光調(diào)制器 (AOM) 包含一個(gè)透明晶體或玻璃，其上附有一個(gè)壓電換能器。 施加到該換能器的射頻 (RF) 波會(huì)誘發(fā)聲波，使晶體產(chǎn)生應(yīng)變，從而形成折射率光柵。 穿過細(xì)胞的光會(huì)經(jīng)歷布拉格衍射。

可實(shí)現(xiàn)的上升/下降時(shí)間與聲波穿過激光束所需的時(shí)間成正比，因此可以通過減小晶體中的光束寬度進(jìn)行優(yōu)化。

辨別力和對(duì)比率由第零個(gè)和第一個(gè)衍射極之間的分離角 (θS) 以及到關(guān)注的工作平面的距離進(jìn)行定義。

雙光子顯微成像中最常用的 AOM 材料是二氧化碲 (TeO2)。 這種材料在很寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有出色的衍射效率和高功率處理能力。 使用 30 dBm 左右的適中 RF 功率時(shí)可實(shí)現(xiàn)高透射效率。

圖 4： 可以使用提供的 GUI 直接更改輸出功率，或者用戶可以為逆程消隱和快速抖動(dòng)控制提供額外的快速模擬輸入

TeO2 AOM 通常配置在布拉格相互作用區(qū)中，該區(qū)提供優(yōu)異的一階衍射效率，并徹底湮滅高階。 請(qǐng)注意，要以極低的 RF 功率級(jí)實(shí)現(xiàn)高效率，需要長(zhǎng)度大于 1 cm 的晶體，從而導(dǎo)致不可忽略的群延遲色散 (GDD)。 另外考慮到其他下游光學(xué)器件的色散，尤其是物鏡，基于 AOM 的顯微鏡系統(tǒng)可以通過與配備色散預(yù)補(bǔ)償功能的激光器聯(lián)合使用而受益，以在樣品平面上維持盡可能短的脈沖。

為可調(diào)諧激光器部署 AOM 需要細(xì)致的光學(xué)和控制電子學(xué)設(shè)計(jì)。 由于分離角 (θs) 取決于 RF 驅(qū)動(dòng)頻率(即光柵周期)和激光波長(zhǎng)，因此必須仔細(xì)校準(zhǔn) RF 驅(qū)動(dòng)頻率，以確保在調(diào)諧激光波長(zhǎng)時(shí)顯著減小指向變化。 此外，還應(yīng)在不同 RF 功率下為不同波長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)高衍射效率。 盡管 AOM 具有出色的性能特點(diǎn)，但由于需要仔細(xì)控制 RF 頻率和功率，并需要在可調(diào)諧成像系統(tǒng)中管理相對(duì)較大的 GVD，因此集成工作變得更加繁重，到目前為止，這已經(jīng)限制了 AOM 在許多自制者和定制場(chǎng)景中的使用。

寬可調(diào)激光器中的調(diào)制

約 680-1300 nm 波長(zhǎng)且功率超過 2 W 的一體式寬可調(diào)諧激光器的出現(xiàn)，需要為激光調(diào)制的性能和集成工作實(shí)施一種新的機(jī)制。

圖 5： Discovery TPC 支持的高對(duì)比度、快速幀速率鈣成像示例。[1](在 1100nm 激光激發(fā)下表達(dá) RCaMP1.07 的神經(jīng)元(紅色)和在 940nm 激光激發(fā)下表達(dá) GCaMP6s 的星形膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)的重疊圖，小鼠活體內(nèi)。 激發(fā)源 Chameleon Discovery TPC。 蘇黎世大學(xué) Weber 實(shí)驗(yàn)室供圖)

通常使用的 KD*P 普克爾斯盒在高功率下會(huì)顯示熱暈效應(yīng)，這對(duì)光束指向、束腰完整性和壽命都是有害的。 更長(zhǎng)的波長(zhǎng)會(huì)進(jìn)一步帶來更高驅(qū)動(dòng)電壓和對(duì)比率挑戰(zhàn)。 鉭酸鋰是一種可行的 EOM 材料，可用于更寬的調(diào)諧，但商業(yè)裝置的群延遲色散高于色散補(bǔ)償激光器的可校正范圍，從而導(dǎo)致更長(zhǎng)的脈沖并降低峰值功率，不利于高效成像。

如前所述，盡管具有潛在的成本和性能優(yōu)勢(shì)，但基于 AOM 的解決方案需要高度的光學(xué)設(shè)計(jì)和電子控制專業(yè)知識(shí)才能部署，許多生物成像設(shè)施中通常并不具有此類裝置。 即便如此，仍可作為一種集成解決方案從某些顯微鏡供應(yīng)商購買 AOM 解決方案。

2017 年，相干公司意識(shí)到，將 AOM 調(diào)制與激光源集成在一起的配套式解決方案將會(huì)讓用戶和顯微鏡行業(yè)受益。 基于從工業(yè)超快加工激光器的集成 AOM 解決方案中收集到的專業(yè)知識(shí)，相干公司開發(fā)了全功率控制 (TPC)，作為 Chameleon Discovery 激光器的完全集成選項(xiàng)。

自動(dòng)免持包裝中的 Chameleon Discovery NX 上提供的全功率控制可在 660 nm 至 1320nm 的整個(gè)全倍頻程調(diào)諧范圍內(nèi)提供高對(duì)比度 (>1000:1) 和高速(上升時(shí)間 <1 μs)調(diào)制。

RF 頻率和功率校準(zhǔn)與調(diào)整的所有繁瑣要求都已在激光器內(nèi)部進(jìn)行編程，因此用戶或顯微鏡集成商只需提供所需的設(shè)定波長(zhǎng)和功率級(jí)即可。

由于 AOM 非常經(jīng)濟(jì)高效，因此，Chameleon Discovery NX TPC 的固定波長(zhǎng) 1040 nm 輸出還配備了自己的AOM 和驅(qū)動(dòng)器。可以通過串行/USB 命令或快速模擬控制輸入方便地控制功率。

未來趨勢(shì)

隨著雙光子成像技術(shù)應(yīng)用范圍向 OEM 和臨床前應(yīng)用的進(jìn)一步拓展，人們對(duì)經(jīng)濟(jì)高效的單波長(zhǎng)飛秒光源的需求日益增長(zhǎng)。 Axon 系列緊湊型超快光源完全滿足了這些要求。

圖 6： 所有 Axon 激光器都以共同的外形尺寸提供 TPC 功能選件。

從產(chǎn)品概念設(shè)計(jì)階段開始，TPC 功能就被集成到了 Axon 設(shè)計(jì)中，以簡(jiǎn)化向新顯微鏡設(shè)計(jì)和應(yīng)用中的部署。 對(duì)于雙光子顯微鏡系統(tǒng)只是活動(dòng)式診斷、臨床或高通量篩選設(shè)備的一部分而不是單純研究?jī)x器的應(yīng)用，這帶來了終極集成便利性。

圖 7： Chameleon Discovery NX TPC 與 Axon 920 TPC 聯(lián)合使用。 TPC 可簡(jiǎn)化光學(xué)布局并節(jié)省寶貴的載臺(tái)空間。 照片由多倫多兒童醫(yī)院 Neil Merovitch 提供。

在神經(jīng)科學(xué)研究中，高功率激光器在使用光遺傳學(xué)刺激的全光體內(nèi)成像技術(shù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Yuste，2012 年)。 數(shù)十瓦的激光功率通過空間光調(diào)制器 (SLM) 拆分成能夠單獨(dú)處理數(shù)十或數(shù)百個(gè)神經(jīng)元的單獨(dú)細(xì)光束。 這種光控制方法需要短且可定制的突發(fā)脈沖。 由于采用全光纖設(shè)計(jì)方式，相干公司 Monaco 這樣的高功率光纖激光器可提供此類應(yīng)用所需的靈活性。 由此產(chǎn)生的高平均功率、高能量激光要求以及在亞毫秒時(shí)間尺度上切換刺激光束的需求為現(xiàn)有的普克爾斯盒技術(shù)帶來了具體挑戰(zhàn)。 為此，AOM 技術(shù)已完全集成到 Monaco 中，以實(shí)現(xiàn)精致的脈沖控制、簡(jiǎn)化的顯微鏡設(shè)計(jì)并提高成像系統(tǒng)的可靠性。

結(jié)論

在本技術(shù)說明中，我們討論了對(duì)雙光子顯微成像中使用的飛秒激光器的激光輸出功率進(jìn)行調(diào)制的兩種主要方法：電光調(diào)制和聲光調(diào)制。 迄今為止，大多數(shù)“自制者”都選擇了 EOM，因?yàn)樵诠饴分胁渴疬@種高壓驅(qū)動(dòng)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單。 顯微鏡的供應(yīng)商們將其 EOM 或 AOM 部分集成在其激光傳輸系統(tǒng)中，利用其軟件架構(gòu)同時(shí)控制顯微鏡和激光。 相干公司利用其為制造 24/7 環(huán)境設(shè)計(jì)的高功率光纖激光器的制造經(jīng)驗(yàn)，意識(shí)到 AOM 方法在尺寸、成本、速度和整體性能方面的優(yōu)勢(shì)也將滿足雙光子成像應(yīng)用的要求。 無論是先進(jìn)的神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用還是醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用，通過將 AOM 的復(fù)雜控制集成到 Discovery NX、Axon 和 Monaco 的激光軟件和硬件架構(gòu)中，雙光子用戶(自制者和顯微鏡公司)可以從較大簡(jiǎn)化且易于控制的光學(xué)裝置中受益。

在本技術(shù)說明中，我們討論了對(duì)雙光子顯微成像中使用的飛秒激光器的激光輸出功率進(jìn)行調(diào)制的兩種主要方法：電光調(diào)制和聲光調(diào)制。 迄今為止，大多數(shù)“自制者”都選擇了 EOM，因?yàn)樵诠饴分胁渴疬@種高壓驅(qū)動(dòng)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單。 顯微鏡的供應(yīng)商們將其 EOM 或 AOM 部分集成在其激光傳輸系統(tǒng)中，利用其軟件架構(gòu)同時(shí)控制顯微鏡和激光。 相干公司利用其為制造 24/7 環(huán)境設(shè)計(jì)的高功率光纖激光器的制造經(jīng)驗(yàn)，意識(shí)到 AOM 方法在尺寸、成本、速度和整體性能方面的優(yōu)勢(shì)也將滿足雙光子成像應(yīng)用的要求。 無論是先進(jìn)的神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用還是醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用，通過將 AOM 的復(fù)雜控制集成到 Discovery NX、Axon 和 Monaco 的激光軟件和硬件架構(gòu)中，雙光子用戶(自制者和顯微鏡公司)可以從較大簡(jiǎn)化且易于控制的光學(xué)裝置中受益。

審核編輯 黃宇