高通量基因測序是什么_高通量測序的意義

“普通的基因測序”應(yīng)該是指“常規(guī)DNA測序”吧，是用Sanger法（也就是雙脫氧法）進(jìn)行測序的方法，目前非常普遍的是直接用ABI 3730xl 進(jìn)行的自動(dòng)測序，基本上可以做到600bp-800bp的讀長。

高通量測序的概念其實(shí)是一個(gè)相對的概念，在2000年的時(shí)候，3700、MegaBace等儀器上的測序也是高通量測序，是相對手工測序或者跑平板膠來說的。

不過到2005年以后，高通量測序就改指第二代測序（Next generation sequencing），454、Solexa（后改為Illumina）和SOLiD等第二代測序，比3730等第一代測序的通量提高了成千上萬倍，甚至上億倍，所以稱為高通量測序。

NGS的特點(diǎn)主要有：

1、通量高。一個(gè)RUN能產(chǎn)生500Mb-600Gb的數(shù)據(jù)量。

2、讀長相對較短。454（約400-500bp），llumina（100-250bp），SOLiD（75-100）。

3、單位數(shù)據(jù)的成本非常低?，F(xiàn)在很多項(xiàng)目測序的費(fèi)用。已經(jīng)非常低。生物信息分析成本變得更為重要了。

高通量基因測序是什么

測序方案建立在雙脫氧測序法（Sanger等，1977）的基礎(chǔ)上。為了從每一克隆插入片段兩端成對地進(jìn)行測序，每一個(gè)質(zhì)粒模板DNA板應(yīng)配備兩個(gè)384孔循環(huán)測序反應(yīng)板。測序反應(yīng)采用Big Dye Terminator chemistry version 3．1（AppliedBiosystems）和標(biāo)準(zhǔn)M13或常用正向引物和反向引物。測序反應(yīng)通過BiomekFX（Beckman）移液操作工作站建立。機(jī)械臂負(fù)責(zé)等分模板試樣，起與反應(yīng)液混合的作用，反應(yīng)液含有雙脫氧核苷酸、熒光標(biāo)記的核苷酸、TaqDNA聚合酶、序列引物和緩沖液。模板和反應(yīng)板有條形碼，且在BiomekFX移液操作工作站上有條形碼讀取器跟蹤，確保模板和反應(yīng)液轉(zhuǎn)移中沒有錯(cuò)誤。

30～40線性擴(kuò)增步驟連續(xù)循環(huán)在MJResearchTetrads或9700熱循環(huán)儀（Ap—pliedBiosystems）中進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物可以用異丙醇在室溫下高效率沉淀，4C下保存或懸浮在水中密閉保存。如果測序儀器正常，在掃描反應(yīng)板的條形碼后，會(huì)自動(dòng)為每一反應(yīng)板生成一個(gè)樣品膜。然后將反應(yīng)板移至一臺(tái)ABIPrism3700DNA分析儀或AppliedBiosystems 3730xiDNA分析儀上，進(jìn)行電泳?，F(xiàn)在的多聚體和軟件允許每天在ABIPrism 3700 DNA分析儀上進(jìn)行8次電泳，在AppliedBiosystems 3730xlDNA分析儀上進(jìn)行12次，調(diào)試時(shí)間少于1h。

平行運(yùn)行大量工作的高通量測序設(shè)備通常需要通過實(shí)驗(yàn)室信息管理和樣品跟蹤系統(tǒng)（1aboratory information management and sample tracking system，LIMS）（Kerlavage等，1993）進(jìn)行自動(dòng)化管理。在TIGR，這種系統(tǒng)包括從文庫構(gòu)建早期經(jīng)測序到結(jié)束的樣品跟蹤的整套軟件。經(jīng)過這種處理，數(shù)據(jù)保存在Sybase關(guān)系數(shù)據(jù)庫表格中。

數(shù)據(jù)庫儲(chǔ)存和聯(lián)系在整個(gè)基因組測序流程中所收集的全部數(shù)據(jù)，允許使用者以各種方式回溯數(shù)據(jù)流，可從已經(jīng)注釋的基因回溯到基因的原始測序跟蹤文件。這個(gè)系統(tǒng)包括樣品管理、數(shù)據(jù)輸入、文庫管理和序列加工的客戶端/服務(wù)器應(yīng)用軟件。經(jīng)過多年改進(jìn)，并且結(jié)合新的實(shí)驗(yàn)室方法、新型的儀器和軟件，這一系統(tǒng)已成熟穩(wěn)定。這些整合應(yīng)用包括自動(dòng)載體清除、確定和屏蔽重復(fù)元件、發(fā)現(xiàn)污染的克隆和跟蹤克隆及模板信息。

在測序流程中，生成的模板和序列的質(zhì)量每天可通過用戶友好界面系統(tǒng)地監(jiān)控。這就保證了迅速發(fā)現(xiàn)并改正工作中的潛在問題。通常，質(zhì)量控制和質(zhì)量測評（qualitycontrol/qualityassessment，QC/QA）組共同應(yīng)用質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)。他們負(fù)責(zé)檢驗(yàn)和提供試劑給生產(chǎn)組，并在流程中檢測模板質(zhì)量、調(diào)查失敗和偏離正常表現(xiàn)范圍的情況、監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)質(zhì)量、審計(jì)、確定可改進(jìn)的方面、制作控制文件（標(biāo)準(zhǔn)操作步驟），以保證這些文件具有格式上的一致性和技術(shù)上的準(zhǔn)確性。

高通量測序的意義

高通量測序技術(shù)的誕生可以說是基因組學(xué)研究領(lǐng)域一個(gè)具有里程碑意義的事件。該技術(shù)使得核酸測序的單堿基成本與第一代測序技術(shù)相比急劇下降， 以人類基因組測序?yàn)槔?上世紀(jì)末進(jìn)行的人類基因組計(jì)劃花費(fèi) 30 億美元解碼了人類生命密碼， 而第二代測序使得人類基因組測序已進(jìn)入萬（美）元基因組時(shí)代。如此低廉的單堿基測序成本使得我們可以實(shí)施更多物種的基因組計(jì)劃從而解密更多生物物種的基因組遺傳密碼。同時(shí)在已完成基因組序列測定的物種中， 對該物種的其他品種進(jìn)行大規(guī)模地全基因組重測序也成為了可能。