利用ATP生物發(fā)光技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量檢測(cè)儀的設(shè)計(jì)

1、 引言

細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)是食品衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的重要檢測(cè)指標(biāo)，主要是用來(lái)判斷食品被污染的程度。對(duì)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)一直是該領(lǐng)域內(nèi)重要的研究課題。對(duì)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法是平板計(jì)數(shù)法，需要將樣品用營(yíng)養(yǎng)瓊脂37℃培養(yǎng)48 h記數(shù)，測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。ATP生物發(fā)光檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快、成本低、易于操作等特點(diǎn)，已引起眾多研究者關(guān)注。同時(shí)，因?yàn)锳TP生物發(fā)光技術(shù)以生物體內(nèi)的ATP作為檢測(cè)對(duì)象，不僅包括細(xì)菌，也包括體細(xì)胞在內(nèi)的食品殘?jiān)仁称肺廴疚铮虼诉m合在食品衛(wèi)生檢測(cè)領(lǐng)域?qū)πl(wèi)生狀況進(jìn)行快速檢測(cè)。

使用ATP生物發(fā)光技術(shù)測(cè)量ATP最早見(jiàn)于1949年Mcelroy的報(bào)道。自此以后，ATP生物發(fā)光技術(shù)引起廣泛關(guān)注。本文在分析前人工作的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀，選擇光電倍增管（H5773-02，日本，濱松光子）作為光電轉(zhuǎn)換器件，其峰值響應(yīng)波長(zhǎng)為500 nm，與反應(yīng)所發(fā)熒光波長(zhǎng)基本一致，從而提高檢測(cè)靈敏度。本檢測(cè)儀采用自動(dòng)加樣技術(shù)，在加入被檢測(cè)樣品后，在反應(yīng)腔內(nèi)由自動(dòng)加樣裝置向檢測(cè)樣品池中自動(dòng)加入反應(yīng)試劑，從而既避免了外界光的干擾，也有效地提高了加樣精度，從而提高了儀表的檢測(cè)可靠性及準(zhǔn)確性。利用本檢測(cè)儀對(duì)10-6～10-14mol／L標(biāo)準(zhǔn)ATP樣品進(jìn)行了檢測(cè)，輸出信號(hào)與樣品濃度間的相關(guān)性達(dá)到0.986，可以滿足測(cè)量要求。

2、 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

2.1 檢測(cè)原理

ATP即三磷酸腺苷，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種能量物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，在生理?xiàng)l件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含ATP的含量大致相同，約為10-18mol／個(gè)。螢火蟲熒光素酶簡(jiǎn)稱蟲光素酶，是一種能將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿幕钚缘鞍踪|(zhì)，即生物催化劑。ATP在蟲光素酶的催化作用下，與熒光素在有氧環(huán)境及二價(jià)鎂離子作用下，反應(yīng)釋放出熒光。當(dāng)熒光素及蟲光素酶過(guò)量情況下，釋放的熒光與ATP在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，因此可以通過(guò)測(cè)量熒光光強(qiáng)檢測(cè)樣品中的ATP，進(jìn)而檢測(cè)其中的細(xì)菌總數(shù)。

2.2 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

本檢測(cè)儀的結(jié)構(gòu)如圖1所示，主要包括三部分，分別為自動(dòng)進(jìn)樣單元、光電轉(zhuǎn)換單元和信號(hào)采集處理及控制單元。其中，自動(dòng)進(jìn)樣單元包括三套蠕動(dòng)泵（WX10，保定蘭格恒流泵有限公司）和試劑盒，分為獨(dú)立三路加樣通路，分別為體細(xì)胞裂解劑、細(xì)菌細(xì)胞裂解劑和熒光素一熒光素酶發(fā)光試劑。根據(jù)測(cè)試需要，蠕動(dòng)泵在控制單元控制下，向光電轉(zhuǎn)換單元中的樣品池加入對(duì)應(yīng)反應(yīng)試劑。光電轉(zhuǎn)換單元包括檢測(cè)樣品池和光電轉(zhuǎn)換器件。為消除外界光的干擾，整個(gè)光電轉(zhuǎn)換單元被密封在暗盒中。光電轉(zhuǎn)換器件將反應(yīng)釋放熒光轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，由信號(hào)采集處理單元采集并處理，并對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)顯示和存儲(chǔ)。

2.3 電路設(shè)計(jì)

系統(tǒng)的電路結(jié)構(gòu)如圖2所示。光電轉(zhuǎn)換器件將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電流信號(hào)，通過(guò)微處理芯片ADuC834（Analog Devices，美國(guó)）對(duì)信號(hào)進(jìn)行采集及處理。ADuC834同時(shí)作為控制核心，控制自動(dòng)加樣單元，顯示及存儲(chǔ)單元，并可將測(cè)量結(jié)果通過(guò)RS232接口上傳至上位機(jī)以進(jìn)行結(jié)果分析。

2.4 軟件設(shè)計(jì)

檢測(cè)儀表的操作軟件由C語(yǔ)言編寫，軟件結(jié)構(gòu)如圖3所示，共分三項(xiàng)功能模塊，分別為測(cè)量、記錄和儀表設(shè)置。其中，測(cè)量分為儀表獨(dú)立測(cè)量和連接電腦測(cè)量。儀表獨(dú)立測(cè)量時(shí)，微處理芯片ADuC834對(duì)一定時(shí)間內(nèi)的信號(hào)采集并進(jìn)行積分處理，然后將測(cè)試結(jié)果實(shí)時(shí)顯示，根據(jù)用戶選擇也可將測(cè)試結(jié)果上傳至計(jì)算機(jī)；聯(lián)機(jī)測(cè)量時(shí)，ADuC834對(duì)所采集的信號(hào)不進(jìn)行處理，而是直接將其傳送到上位計(jì)算機(jī)中，并實(shí)時(shí)顯示時(shí)間響應(yīng)曲線，方便用戶在計(jì)算機(jī)對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適合于實(shí)驗(yàn)室中的測(cè)試分析。記錄子菜單分為記錄查詢和記錄刪除，用以對(duì)記錄進(jìn)行操作。采用24LC256作為外部數(shù)據(jù)存儲(chǔ)芯片，本儀表設(shè)計(jì)可存儲(chǔ)測(cè)試結(jié)果200條，記錄查詢時(shí)可對(duì)逐條記錄進(jìn)行顯示；記錄刪除則分為逐條刪除和全部刪除；設(shè)置子菜單可實(shí)現(xiàn)儀表校準(zhǔn)和倍增管電壓調(diào)整兩項(xiàng)功能。

3 、實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

3.1 器件選取

由于ATP生物發(fā)光所發(fā)光強(qiáng)較弱，因此本檢測(cè)儀選用高靈敏的光電倍增管作為光電轉(zhuǎn)換器件。利用F-4500熒光分光光度計(jì)（日本，日立）對(duì)ATP生物發(fā)光反應(yīng)所發(fā)熒光波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，峰值波長(zhǎng)約為550 nm。為保證檢測(cè)具有更高靈敏度，所選光電倍增管的響應(yīng)波長(zhǎng)應(yīng)與熒光波長(zhǎng)一致。日本濱松光子的H5773-02型光電倍增管的響應(yīng)波長(zhǎng)為330～850 nm，峰值檢測(cè)波長(zhǎng)在500～600 nm基本保持恒定，因此符合本系統(tǒng)設(shè)計(jì)要求。

3.2 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)ATP樣品作為檢測(cè)對(duì)象，濃度范圍為10-6～10-14mol／L，實(shí)驗(yàn)中所用熒光素及熒光素酶購(gòu)自美國(guó)普洛麥格公司。實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)機(jī)測(cè)量方式，將本檢測(cè)儀與計(jì)算機(jī)通過(guò)。RS232接口相連接，儀表信號(hào)采集單元采集熒光信號(hào)后直接上傳至計(jì)算機(jī)并將測(cè)試結(jié)果實(shí)時(shí)顯示。測(cè)量結(jié)果如圖4所示。

在反應(yīng)中，加入發(fā)光反應(yīng)試劑時(shí)，體系中樣品濃度相對(duì)較高，因此在短時(shí)間內(nèi)即迅速反應(yīng)釋放大量熒光，此時(shí)熒光光強(qiáng)較強(qiáng)，因此測(cè)量結(jié)果可能會(huì)超出系統(tǒng)的測(cè)試量程。由于本儀表的最大輸出電壓為2500 mV，反應(yīng)初期釋放的熒光可能會(huì)超出該范圍，在圖中表現(xiàn)為前端的水平直線。隨著反應(yīng)進(jìn)行，體系中樣品和試劑的濃度逐漸降低，所釋放熒光隨之逐漸衰減。由圖可見(jiàn)，不同樣品濃度的ATP隨反應(yīng)進(jìn)行，進(jìn)入測(cè)量量程的時(shí)間不同，濃度越高，衰減越慢，進(jìn)入測(cè)量量程的時(shí)間越長(zhǎng)，反之越短。對(duì)圖4中各響應(yīng)曲線400 s內(nèi)的測(cè)量值進(jìn)行積分，作為各濃度樣品的輸出信號(hào)。輸出信號(hào)與濃度的關(guān)系如圖5所示。由圖可以看出，輸出信號(hào)隨濃度增加而增加，且有明顯梯度，兩者的線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.986。這一結(jié)果說(shuō)明本檢測(cè)系統(tǒng)可以對(duì)ATP濃度進(jìn)行快速檢測(cè)。由于細(xì)菌細(xì)胞中所含ATP含量基本一致，因此，本檢測(cè)儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌總數(shù)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

4、 結(jié) 論

本文針對(duì)細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)需求，設(shè)計(jì)了一種基于ATP生物發(fā)光技術(shù)的細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)儀。該檢測(cè)儀在對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)品進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，選擇H5773-02光電倍增管作為光電轉(zhuǎn)換器件，其檢測(cè)波長(zhǎng)與生物發(fā)光反應(yīng)所釋放熒光波長(zhǎng)一致，可有效提高檢測(cè)靈敏度。采用自動(dòng)加樣技術(shù)，在暗室內(nèi)加入發(fā)光反應(yīng)試劑，消除了外界光的干擾，且獲得了反應(yīng)最初的信號(hào)。本文以細(xì)菌檢測(cè)的中間產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液作為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)所設(shè)計(jì)的檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)試。將檢測(cè)儀與計(jì)算機(jī)連接測(cè)量，獲得了各反應(yīng)所釋放熒光強(qiáng)度的時(shí)間響應(yīng)曲線。在此基礎(chǔ)上，對(duì)響應(yīng)曲線400 s內(nèi)的值進(jìn)行積分，作為對(duì)應(yīng)樣品濃度的輸出信號(hào)，得到了輸出電壓與濃度的關(guān)系曲線，兩者的線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.986，可滿足測(cè)試要求。本文所設(shè)計(jì)的針對(duì)細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)儀具有檢測(cè)速度快、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單、小型便攜等特點(diǎn)，在口岸、衛(wèi)生監(jiān)管部門、食品生產(chǎn)部門等對(duì)產(chǎn)品、環(huán)境等的衛(wèi)生狀況進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。