一種基于微噴頭的異質(zhì)螺旋凝膠微球的三維打印工藝

摘要：“一花一世界、一葉一菩提”蘊(yùn)含的是東方的世界觀，“There is plenty of room at the bottom”是科學(xué)家費(fèi)曼對(duì)微納制造能力的暢想。這幾年我們一直在想，是否有可能在一個(gè)微小空間里構(gòu)造出復(fù)雜的活性結(jié)構(gòu)，并加以體外培養(yǎng)構(gòu)造出迷你組織？迷你組織有很多應(yīng)用，諸如其細(xì)胞注射治療更好的替代方案、藥物篩選的理想器官模型、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)研究組織發(fā)育的工具等。由于水凝膠是典型軟材料，高精度制造一直是業(yè)界難點(diǎn)，此外多細(xì)胞在微小的空間內(nèi)的高效操縱更是一個(gè)挑戰(zhàn)。受限于現(xiàn)有制造工藝的分辨率以及三維成型能力，想要在有限的微尺寸中重建人體組織異質(zhì)微結(jié)構(gòu)目前仍缺乏有效方法。經(jīng)過(guò)近三年的研究，本課題組發(fā)明了一種在微球內(nèi)打印活性結(jié)構(gòu)，構(gòu)造迷你組織的生物3D打印方法，能在微球內(nèi)制造出螺旋面、玫瑰花、太極等復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。基于本方法，我們?cè)诠撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞微球中打印出內(nèi)皮螺旋結(jié)構(gòu)，建立了帶螺旋形血管的成骨類器官，為體外重建復(fù)雜類器官提供了新的思路。

人造組織/器官對(duì)于研究人體組織發(fā)展和病變以及器官移植具有十分重要的研究意義。如今，隨著人體類器官在體外模型中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)人員對(duì)模型的空間異質(zhì)性以及結(jié)構(gòu)功能性提出了越來(lái)越高的要求。異質(zhì)凝膠微球的出現(xiàn)為這項(xiàng)研究提供了新的技術(shù)路線。異質(zhì)凝膠微球在多組分、形態(tài)可控、使用方便等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)在組織工程、藥物釋放、生物探針以及再生醫(yī)學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域取得了重要發(fā)展，并演化出了核殼結(jié)構(gòu)、多組分分區(qū)結(jié)構(gòu)等各種形態(tài)。但已有的制造工藝無(wú)法可控制造出具有高成型分辨率、三維分布可控的異質(zhì)凝膠微球，也就無(wú)法重建復(fù)雜的體外人體組織。

課題組提出了一種基于微噴頭的異質(zhì)螺旋凝膠微球的三維打印工藝，首次實(shí)現(xiàn)了諸如球面螺旋、太極圖案、玫瑰花圖案等復(fù)雜形態(tài)，并大大提高了細(xì)胞組分凝膠在微球內(nèi)的打印精度，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞螺旋線排列。該方法采用基于多通道微流控芯片的微噴頭，將含有不同細(xì)胞組分的水凝膠通過(guò)精確注射產(chǎn)生比例可調(diào)的分區(qū)形凝膠液滴；同時(shí)通過(guò)位于噴頭底部的氣流噴頭產(chǎn)生可控氣流使液滴產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞在液滴內(nèi)部按照螺旋結(jié)構(gòu)排列。打印過(guò)程實(shí)現(xiàn)了多組分的比例調(diào)節(jié)以及氣流噴頭位置的在線監(jiān)測(cè)，分辨率高。和現(xiàn)有制造方法相比，其最大的特點(diǎn)是首次實(shí)現(xiàn)了三維結(jié)構(gòu)的可控成型，并將成型精度提高到了單細(xì)胞分辨率。

人體組織具有多尺度的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，比較典型的為具有復(fù)雜形貌和功能的血管化組織。在傳統(tǒng)研究中，為了實(shí)現(xiàn)該類型組織的構(gòu)建，通常采用組織支架進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。然而由于其細(xì)胞分布以及結(jié)構(gòu)形貌具有高度的自發(fā)性和隨機(jī)性，因此極大地限制了其應(yīng)用。采用該研究提出的螺旋凝膠微球能夠很方便地進(jìn)行體外微三維組織構(gòu)建。該團(tuán)隊(duì)采用同步包裹人體靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（HUMSCs）的方式實(shí)現(xiàn)了在螺旋凝膠微球內(nèi)細(xì)胞共培養(yǎng)微環(huán)境的構(gòu)建。所采用的內(nèi)皮細(xì)胞呈球面螺旋結(jié)構(gòu)分布在間充質(zhì)干細(xì)胞周圍，形象地模擬了人體骨組織微結(jié)構(gòu)的生理特點(diǎn)。最后，在體外培養(yǎng)環(huán)境下分別實(shí)現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞的血管化以及間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨化，初步實(shí)現(xiàn)了體外骨組織類器官的功能化構(gòu)建。該研究在復(fù)雜三維共培養(yǎng)、再生醫(yī)學(xué)、組織工程等領(lǐng)域具有重要的意義。

圖 1. 氣流輔助異質(zhì)螺旋微球類器官的成型工藝

圖 2. 小鼠成纖維細(xì)胞(L929)在螺旋凝膠微球內(nèi)的包裹和增殖

圖 3.基于人體內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的共培養(yǎng)模型實(shí)現(xiàn)體外類器官的制造

圖 4. 基于該方法制造的螺旋異質(zhì)凝膠微球

目前該成果已在WILLY旗下的SMALL期刊發(fā)表，被選為封底論文，通訊作者為浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院的賀永教授、機(jī)械工程學(xué)院的傅建中教授、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的歐陽(yáng)宏偉教授。Airflow‐Assisted 3D Bioprinting of Human Heterogeneous Microspheroidal Organoids with Microfluidic Nozzle[J]. Small, 2018: 1802630.