科學(xué)家開發(fā)了一種能夠區(qū)分單分子核酸和單細胞差異的方法

科學(xué)家開發(fā)了一種能夠區(qū)分單分子核酸和單細胞差異的方法，即將含有核酸或細胞的水相通過特殊設(shè)計的微流控芯片注入到油相中，生成大小一致的微米級液滴，使單個核酸或細胞從群體中分離并包裹在微滴中，進而研究單分子或單細胞之間的差異。對每個微滴進行連續(xù)不斷的觀測將會有助于人們理解單分子反應(yīng)動力學(xué)的變化和細胞行為的不同。

將粒徑均勻的水相微滴分散到連續(xù)的油相中是違反熱力學(xué)平衡的。微滴會不斷地融合形成大的液滴，直至水油兩相發(fā)生分層，在油相中加入表面活性劑（Abil EM 90、PFPE-PEG、Span 80）可以延緩液滴融合，但不能消除這一現(xiàn)象。因此在長期的單細胞培養(yǎng)中人們依然可以觀察到微滴融合，并且這一現(xiàn)象在溫度劇烈變化的數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（digital PCR）中更加明顯（圖1）。數(shù)字PCR中液滴融合會影響定量的準確性并造成稀有樣品的浪費。此外，液體的流動性使對單個微滴進行跟蹤觀察變得十分困難。近日，浙江大學(xué)牟穎教授團隊研發(fā)出一種熱凝固的油相物質(zhì)能夠解決液滴融合和液滴流動的問題，實現(xiàn)了對單個液滴的實時監(jiān)控。

圖1. 液滴數(shù)字PCR反應(yīng)后液滴融合

牟穎教授團隊研發(fā)的這種熱凝固材料由低粘度的甲基硅油、乙烯基硅油、含氫硅油、非離子表面活性劑和鉑催化劑組成。這種新型的油相能夠在鉑催化下通過乙烯基硅油和含氫硅油發(fā)生硅氫化反應(yīng)自發(fā)凝固，不需要紫外或帶點離子等外界條件觸發(fā)。油相中表面活性劑的作用是生成粒徑均一的液滴和在油凝固之前穩(wěn)定液滴。在凝固前，該油相可用來生成多種類型的液滴：（a）水包油(O/W)、（b）油包水(W/O)、（c）水包油包水(W/O/W)和（d）雙核乳滴（圖2）。

圖2. 可凝固油相生成的多種類型液滴

這種可凝固材料的固化速度與溫度有關(guān)。在細胞培養(yǎng)溫度下（37℃），該油相可在70 min內(nèi)凝固，而在PCR反應(yīng)中95 ℃預(yù)變性時，該材料凝固僅需要37 s。在上述條件下，油相由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，液滴也被“凍結(jié)”，失去流動性。相鄰液滴間的液態(tài)隔膜變?yōu)楣虘B(tài)隔膜，液滴被固體包裹使液滴無法融合。當液滴中的水分蒸發(fā)以后，液滴所在位置變成一個個空泡（圖3a）。將芯片縱切后可看到，相鄰的液滴空腔被固態(tài)的隔膜分開（圖3b）。

圖3. 凝固后的油相中液滴蒸發(fā)后形成的空泡

同時，這種熱凝固的油相也具有很好的生物相容性。他們利用該油相物質(zhì)生成的液滴進行液滴數(shù)字PCR（ddPCR）和單細胞培養(yǎng)時，實現(xiàn)了對PCR反應(yīng)和細胞生長過程的實時監(jiān)控，并且對PCR反應(yīng)和細胞生長沒有影響（圖4）。陽性微滴的熒光強度隨著PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加逐漸增強（圖4a）。單個細胞在液滴內(nèi)培養(yǎng)時，分別在48 h和120 h觀察到了細胞分裂（圖4b）。

圖4．可凝固油相中PCR反應(yīng)和細胞生長過程的實時監(jiān)控

此外，數(shù)字PCR反應(yīng)產(chǎn)物也可以從這種可凝固油形成的微囊中完全回收，用于進一步的分析研究，例如測序。