基于inDrop系統(tǒng)的個性化開發(fā)，為未來研究中合理選擇檢測平臺提供了數(shù)據(jù)支持

自2009年湯富酬研究員首次報道其開創(chuàng)性工作以來，單細(xì)胞RNA測序技術(shù)已經(jīng)逐漸成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要方法，其在發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞領(lǐng)域展現(xiàn)出強大的應(yīng)用前景。隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴增方法的不斷優(yōu)化，以及測序通量的持續(xù)提升，研究人員已經(jīng)不再滿足于幾十甚至幾百個單細(xì)胞所提供的信息量。

2015年以來，一系列基于細(xì)胞條形碼標(biāo)記的高通量單細(xì)胞RNA測序技術(shù)被相繼報道，其中尤以哈佛大學(xué)David Weitz實驗室開發(fā)的inDrop和Drop-seq，以及10X Genomics公司開發(fā)的Chromium系統(tǒng)最受關(guān)注。然而，如何從這些技術(shù)中選擇出最適合于自己項目的方法，成為每一個想從事單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的科研人員首先面對的問題。

2018年11月21日，清華大學(xué)生命學(xué)院王建斌研究組和北京大學(xué)BIOPIC黃巖誼研究組以及上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院劉峰研究員緊密合作，在Molecular Cell上發(fā)表了題為Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-seq systems的研究論文，系統(tǒng)比較了inDrop、Drop-seq和Chromium三個系統(tǒng)在單細(xì)胞RNA測序方面的表現(xiàn)，并初步嘗試了基于inDrop系統(tǒng)的個性化開發(fā)，為未來研究中合理選擇檢測平臺提供了數(shù)據(jù)支持。

液滴超高通量單細(xì)胞RNA測序系統(tǒng)（droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-seq systems）基于一個相同的原理，即利用微液滴將單個細(xì)胞與單個微球配對包裹，每個微球上帶有的獨特寡聚核苷酸序列可以對來自于不同單細(xì)胞的RNA進(jìn)行區(qū)分標(biāo)記，之后就可以對數(shù)千個單細(xì)胞的cDNA進(jìn)行合并操作，每一條cDNA的細(xì)胞來源可以在后續(xù)的生物信息學(xué)分析中進(jìn)行解讀。此方法使得實驗人員不必針對每一個單細(xì)胞進(jìn)行繁瑣的重復(fù)操作，大大提高了實驗效率。

研究人員首先系統(tǒng)比較了三個系統(tǒng)的原理設(shè)計（下圖），尤其是微球及寡聚核苷酸序列的特性。通常情況下，細(xì)胞和微球需要分別經(jīng)過高倍稀釋，從而避免同一液滴內(nèi)存在多個細(xì)胞或者微球。由此導(dǎo)致的雙泊松分布大大降低了細(xì)胞的包裹效率。inDrop和Chromium系統(tǒng)所使用的大尺寸水凝膠微球可以被擠壓通過狹窄的微流通道，使得絕大部分液滴中有且僅有一個微球，細(xì)胞的利用率得到了顯著的提高。另一方面，inDrop系統(tǒng)所使用的CEL-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴增技術(shù)耗時較長，整個實驗無法在當(dāng)天完成。

為了有效比較三個系統(tǒng)的技術(shù)參數(shù)，研究人員選擇使用均質(zhì)的淋巴母細(xì)胞作為實驗材料，并開發(fā)了一套同時兼容三個平臺數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析流程。在數(shù)據(jù)分析過程中，研究人員首先發(fā)現(xiàn)微球表面的寡聚核苷酸序列并不完美，尤其是inDrop和Drop-seq系統(tǒng)所用微球，普遍存在內(nèi)部序列不均一的問題。即使經(jīng)過序列校正，inDrop和Drop-seq仍有約一半的測序數(shù)據(jù)無法被有效歸入具體的細(xì)胞，導(dǎo)致的測序數(shù)據(jù)的浪費和檢測靈敏度的下降。另一方面，UMI（unique molecular identifier）的加入可以有效提高inDrop和Drop-seq數(shù)據(jù)的均一性，而其對Chromium數(shù)據(jù)的改善非常有限。最終，在基因數(shù)和轉(zhuǎn)錄本數(shù)方面，三個系統(tǒng)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)均可以用于細(xì)胞亞型分析，其中Chromium系統(tǒng)展示出相對更高的靈敏度。

除了常規(guī)的技術(shù)參數(shù)分析以外，研究人員在對比三個系統(tǒng)所產(chǎn)生數(shù)據(jù)時還發(fā)現(xiàn)了顯著的系統(tǒng)特有差異，具體表現(xiàn)為數(shù)據(jù)按系統(tǒng)來源顯著分成了三個亞群，這提示大家未來在比較不同系統(tǒng)來源的數(shù)據(jù)時，要首先注意系統(tǒng)導(dǎo)致的表達(dá)差異。此外，針對inDrop系統(tǒng)特有的開發(fā)性，研究人員嘗試將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴增方式由CEL-seq改為Smart-seq，并獲得了初步的成果，這展示出inDrop系統(tǒng)在特殊應(yīng)用領(lǐng)域的潛在優(yōu)勢。

近年來，針對整個器官乃至整個生物個體的超大規(guī)模單細(xì)胞研究項目逐漸成為國際會議中討論的焦點，其中尤以美國和歐洲科學(xué)家聯(lián)合開展的人類細(xì)胞圖譜（Human Cell Atlas）計劃最為著名。希望本文能夠?qū)τ幸忾_展單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究的科研人員提供有效的指導(dǎo)。

據(jù)悉，清華大學(xué)生命學(xué)院王建斌研究員和北京大學(xué)BIOPIC黃巖誼教授為本文通訊作者，北京大學(xué)BIOPIC張先念博士、清華大學(xué)生命學(xué)院博士生李天奇、上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院劉峰研究員、北京大學(xué)深圳研究生院博士生陳雅琪為本文共同第一作者。