針對(duì)血液樣本進(jìn)行DIA深度開發(fā)的意義在哪？為什么要用DIA技術(shù)？

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組技術(shù)，如iTRAQ、TMT或者label-free等，采用的是DDA（data-dependent acquisition，數(shù)據(jù)依賴采集）數(shù)據(jù)采集方式，其策略是對(duì)響應(yīng)最高的部分母離子進(jìn)行二級(jí)采集。而新一代的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)DIA（Data Independent Acquisition，數(shù)據(jù)非依賴采集）采用了不同的數(shù)據(jù)采集模式：將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)窗口，然后對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行檢測、碎裂，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的信息，實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)的機(jī)槍掃射的方式向?qū)椶Z炸方式的采集方式轉(zhuǎn)變。

DIA（Data Independent Acquisition，數(shù)據(jù)非依賴采集）作為新一代的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，憑借其導(dǎo)彈轟炸式的全掃描數(shù)據(jù)采集方式，顯著提升了蛋白質(zhì)組學(xué)分析的覆蓋度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，已被眾多頂級(jí)研究應(yīng)用，并發(fā)表于Cell、Science、Nature Medicine、Circulation等雜志。更重要的是，DIA已經(jīng)應(yīng)用于眾多國家級(jí)的精準(zhǔn)醫(yī)療項(xiàng)目，如“癌癥登月計(jì)劃”、“蘇黎世癌癥地圖”、“ProCan項(xiàng)目”等。

上海中科新生命經(jīng)過長期的潛心研發(fā)，已在血液樣本蛋白質(zhì)組學(xué)分析方面實(shí)現(xiàn)新突破：基于DIA技術(shù)，在常規(guī)2h分析時(shí)長、無需去除血液高豐度蛋白、無需分級(jí)的情況下，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)樣本定量>1000個(gè)蛋白?。?！其中線性范圍跨越5-6個(gè)數(shù)量級(jí)。該分析能力，比相同分析條件下的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組分析技術(shù)（如iTRAQ、TMT或label-free）的數(shù)據(jù)量提升不止2倍，也使得服務(wù)行業(yè)中DIA技術(shù)在分析能力方面有了質(zhì)的提升!

中科新生命本次在血液蛋白質(zhì)組學(xué)上的技術(shù)突破獲得了行業(yè)內(nèi)的廣泛關(guān)注，也非常希望同對(duì)DIA技術(shù)感興趣的老師與同行，進(jìn)行廣泛溝通與交流，共同推動(dòng)技術(shù)發(fā)展與進(jìn)步。我們整理了幾個(gè)最為關(guān)注的問題與大家共享：

出發(fā)點(diǎn)：針對(duì)血液樣本進(jìn)行DIA深度開發(fā)的意義在哪？

重要性：血液樣本毫無疑問是臨床醫(yī)學(xué)研究最重要、最高頻分析的樣本類型，尤其在標(biāo)志物研究方面具有無可替代的地位。

傳統(tǒng)技術(shù)的瓶頸：血液樣本是蛋白質(zhì)組分析的難點(diǎn)，因?yàn)檠褐械陌椎鞍?、IgG等高豐度蛋白占據(jù)了90%以上的含量，而質(zhì)譜會(huì)反復(fù)掃描這些高豐度蛋白，導(dǎo)致有意義的低豐度蛋白被采集到的過少。因此，為了能夠檢測到更多、更有意義的蛋白質(zhì)，在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)的分析模式下，目前的常規(guī)策略是：先通過親和方法去除高豐度蛋白，再通過大量的預(yù)分級(jí)進(jìn)行檢測。該分析模式的問題在于：

（1） 關(guān)于高豐度蛋白的去除問題：高豐度蛋白本身雖然不是大家研究的對(duì)象，但卻是重要的載體，血液中非常多的蛋白、代謝分子都會(huì)與高豐度蛋白結(jié)合。高豐度蛋白去除的同時(shí)，很多與其結(jié)合的蛋白也會(huì)被去除。因此，高豐度蛋白的去除過程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性、準(zhǔn)確性有一定的影響。有數(shù)據(jù)表明，對(duì)于某些重要蛋白，去除高豐度會(huì)影響這些重要蛋白是否表達(dá)差異確定。

（2） 關(guān)于精準(zhǔn)醫(yī)療、標(biāo)志物研究的問題：在精準(zhǔn)醫(yī)療、大數(shù)據(jù)分析的研究模式下，臨床樣本的分析方案，已經(jīng)逐漸摒棄將組內(nèi)樣本混合的模式，而是傾向于將每個(gè)樣本進(jìn)行獨(dú)立的采集和分析。因?yàn)椋@種模式能盡可能保留信息的完整性、真實(shí)性，更有利于數(shù)據(jù)的有效分析和延展性挖掘。在這種大規(guī)模樣本的分析過程中，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組分析模式采用的大規(guī)模高豐度蛋白去除、大規(guī)模預(yù)分級(jí)實(shí)驗(yàn)過程，不僅意味著巨大的實(shí)驗(yàn)成本，更重要的是其對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的平行性是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)（這些預(yù)處理過程造成的實(shí)驗(yàn)誤差，是難以通過內(nèi)標(biāo)、算法等方式校正回來的）。

為什么要用DIA技術(shù)？

首先，不同于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組的優(yōu)先采集高強(qiáng)度信號(hào)的DDA數(shù)據(jù)采集模式，DIA采用的全掃描采集模式，使得其受到高豐度信號(hào)的影響大大降低。所以DIA在血液這種高豐度蛋白構(gòu)成特點(diǎn)的樣本分析上，會(huì)更有優(yōu)勢。越難的樣本，DIA越能發(fā)揮出技術(shù)特色。上海中科新生命的DIA平臺(tái)還對(duì)激光顯微切割的組織樣本進(jìn)行過分析，其數(shù)據(jù)量也比常規(guī)方法提高0.5-1倍。其次，DIA所具備的高重現(xiàn)性、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，可以在大規(guī)模樣本分析過程中，盡可能地保證平行性和準(zhǔn)確性，無疑是精準(zhǔn)醫(yī)療、標(biāo)志物研究等大規(guī)模樣本分析項(xiàng)目的首選，這也是為什么美國、瑞士、澳大利亞的精準(zhǔn)醫(yī)療國家項(xiàng)目均采用DIA平臺(tái)的原因之一。

血液DIA的分析能力提高這么多，可信度有多高？

對(duì)于血液DIA的分析能力一下子提高了這么多，相信很多人肯定會(huì)產(chǎn)生疑問。所以我們已經(jīng)對(duì)DIA數(shù)據(jù)設(shè)置了嚴(yán)格、高標(biāo)準(zhǔn)的“三重?cái)?shù)據(jù)過濾”：protein FDR、peptide FDR和score值。其次，在分析平臺(tái)方面也進(jìn)行了改進(jìn)，主要包括以下兩方面：

色譜提升：一方面，在蛋白質(zhì)組的分析流程中，色譜的重要性不亞于質(zhì)譜，色譜的分離效果，直接影響質(zhì)譜對(duì)信號(hào)的采集效率。另一方面，質(zhì)譜采集到的信號(hào)，是否能夠用于定量，也需要滿足一定的色譜峰條件。色譜的穩(wěn)定性，還直接決定了數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。

數(shù)據(jù)庫提升：質(zhì)譜獲得原始數(shù)據(jù)只是圖譜與數(shù)字符號(hào)，數(shù)據(jù)庫搜索過程決定了原始數(shù)據(jù)有多少可以變?yōu)檎嬲杏玫臄?shù)據(jù)。DIA技術(shù)由于全掃描的采集方式，其原始數(shù)據(jù)的復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組技術(shù)，高度依賴于預(yù)先構(gòu)建的圖譜庫對(duì)DIA的數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫。由于我們是最早開展DIA分析的平臺(tái)，在已經(jīng)積累了大量血液樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)的前提下，已經(jīng)構(gòu)建成功獨(dú)有的血液樣本圖譜庫。項(xiàng)目開展過程中，不但會(huì)為每個(gè)項(xiàng)目構(gòu)建其特有的圖譜庫，還會(huì)加上本平臺(tái)自有的血液圖譜庫，從而實(shí)現(xiàn)更高覆蓋度地對(duì)DIA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

總 結(jié)

在大規(guī)模樣本分析的情況下，除了DIA本身具有的高覆蓋度、高重現(xiàn)性和高準(zhǔn)確性上的優(yōu)勢外，其無需去除高豐度蛋白、無需進(jìn)行預(yù)分級(jí)的優(yōu)勢，最大程度地保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和平行性。在原有DIA分析體系的基礎(chǔ)上，升級(jí)的分析體系進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了更深度的檢測，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)量的進(jìn)一步提升。