在肝臟芯片上進(jìn)行肝細(xì)胞三維培養(yǎng)取得重大進(jìn)展

肝臟芯片（liver-on-a-chip）細(xì)胞培養(yǎng)裝置是藥物發(fā)現(xiàn)、毒理研究和組織工程研究中的有吸引力的仿生模型。為了在實(shí)驗(yàn)室芯片上維持特定的肝細(xì)胞功能，必須具備充足的細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件，包括三維細(xì)胞定位和持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)物和氧氣供應(yīng)。與傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，器官芯片（organ-on-a-chip）裝置提供了多功能性和有效的仿生技術(shù)，適用于藥物發(fā)現(xiàn)和醫(yī)學(xué)上的高級(jí)應(yīng)用。

在一項(xiàng)新的發(fā)表在Biofabrication期刊上的研究中，Jonas Christoffersson及其同事們證實(shí)了模仿胞外基質(zhì)的水凝膠如何支持灌注肝臟芯片裝置中的肝細(xì)胞功能和活力。這些研究人員設(shè)計(jì)了一種基于透明質(zhì)酸和聚（乙二醇）（HA-PEG）聚合物的水凝膠系統(tǒng)。他們利用點(diǎn)擊化學(xué)開發(fā)出這種水凝膠。為了做到這一點(diǎn)，他們讓環(huán)辛炔部分和炔烴疊氮化物標(biāo)記的反應(yīng)物之間發(fā)生雙正交反應(yīng)（在生命系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，沒(méi)有天然生物化學(xué)反應(yīng)的干擾），即應(yīng)變促進(jìn)的炔烴疊氮化物環(huán)加成（strain-promoted alkyne azide cycloaddition, SPAAC）。

圖片來(lái)自Biofabrication, doi:10.1088/1758-5090/aaf657

通過(guò)與現(xiàn)有的瓊脂糖和藻酸鹽水凝膠相比較，這些研究人員在細(xì)胞相容性（cytocompatibility）方面設(shè)計(jì)并表征了這種新型凝膠材料。對(duì)于生物功能化研究，他們使用了源自人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的肝細(xì)胞（hiPSC-HEP）。為了改善這種生物材料的表面細(xì)胞相容性，利用疊氮化物修飾的細(xì)胞粘附基序改變HA-PEG水凝膠，從而促進(jìn)有效的細(xì)胞-材料附著。在這種表面功能化的生物材料中，這些產(chǎn)生肝細(xì)胞的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（hiPSC）在三維空間中遷移和生長(zhǎng)，并且具有增加的活力。與在其他水凝膠上培養(yǎng)的細(xì)胞相比，他們觀察到在這種新材料上的白蛋白（一種特征性的肝臟蛋白）產(chǎn)量更高。這種靈活的對(duì)hipsC-HEP進(jìn)行灌注三維細(xì)胞培養(yǎng)的SPAAC交聯(lián)水凝膠系統(tǒng)是優(yōu)化肝臟芯片裝置的有前途的材料。

稱為“器官芯片”的小型化生物反應(yīng)器最近已成為一種替代性的細(xì)胞培養(yǎng)模型，可更好地模擬實(shí)驗(yàn)室中的體內(nèi)生物微環(huán)境。鑒于在臨床藥物開發(fā)的所有階段觀察到藥物肝毒性，肝臟是醫(yī)學(xué)研究中的一種特別令人感興趣的模型。之前的研究已詳細(xì)介紹了使用器官芯片來(lái)預(yù)測(cè)藥物在臨床試驗(yàn)中的影響，并評(píng)估實(shí)驗(yàn)室中藥物與肝細(xì)胞之間的相互作用。

鑒于生物反應(yīng)器在學(xué)術(shù)和工業(yè)環(huán)境中的廣泛應(yīng)用，它們需要優(yōu)化的材料和條件以便實(shí)現(xiàn)高通量制造。這些條件包括替換常見(jiàn)的原型材料聚二甲基硅氧烷（PDMS），將源自hipsC的細(xì)胞整合到柔軟的生物材料上來(lái)促進(jìn)它們的生長(zhǎng)，并最大限度地減少由器官芯片裝置中的微流體容器和管道系統(tǒng)引起的較大死區(qū)體積。

這項(xiàng)研究中制備的新型生物材料含有兩種通過(guò)SPAAC交聯(lián)在一起的主要成分：cycloocytne修飾的透明質(zhì)酸（cycloocytne-modified hyaluronan, HA-BCN）和多臂疊氮化物修飾的PEG [p(N3)8]。HA-BCN中的BCN與末端為疊氮化物（N3）部分的8臂PEG聚合物上的N3發(fā)生反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的1,2,3-三唑類化合物。Christoffersson等人在生理?xiàng)l件下完成化學(xué)反應(yīng)，這就形成粘彈性可調(diào)整的水凝膠。這種交聯(lián)策略是制備用于三維細(xì)胞培養(yǎng)的水凝膠的理想選擇，這是因?yàn)榧?xì)胞能夠被包埋在這種生物材料中而不會(huì)破壞它們的活力并且適合用于微流體裝置中。他們?cè)谶@種新型生物材料上使用了過(guò)量的SPAAC部分來(lái)連接不同的配體，包括促進(jìn)在細(xì)胞-材料界面相互作用的RGD肽。

在此之后，這些研究人員通過(guò)振蕩流變學(xué)技術(shù)（oscillatory rheology, 測(cè)量軟材料的粘彈性行為的技術(shù)）來(lái)改變這兩種主要成分的組成，以便了解所產(chǎn)生的粘彈性，比如這種水凝膠的儲(chǔ)能模量（storage modulus, G'）和損耗模量（loss modulus, G"）。他們?cè)谏叩臏囟认驴刂屏诉@種新型水凝膠的凝膠化動(dòng)力學(xué)。這種新型生物材料的凝膠化動(dòng)力學(xué)對(duì)細(xì)胞均勻分布來(lái)說(shuō)足夠慢，但對(duì)防止細(xì)胞沉降來(lái)說(shuō)足夠快?？刂颇z化動(dòng)力學(xué)的能力讓他們能夠考慮微流體系統(tǒng)中用于器官芯片上的多種生物制造策略（比如生物打?。┖退z組裝。

Christoffersson等人接下來(lái)將HA-PEG水凝膠與成熟的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架---瓊脂糖和藻酸鹽水凝膠---進(jìn)行比較。為了確定適合于三維細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的最終粘彈性，他們使用振蕩流變學(xué)技術(shù)來(lái)研究不同的聚合物濃度。他們通過(guò)使用掃描電子顯微鏡（SEM）圖像分析了最終材料的組成。

肝臟芯片設(shè)計(jì)和設(shè)置必須滿足這項(xiàng)研究中的兩個(gè)關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)：（1）允許灌注的細(xì)胞培養(yǎng)基通過(guò)這種水凝膠的表面，以便與包封的肝細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基交換；（2）在正在進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)期間，允許對(duì)灌注的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行取樣用于實(shí)驗(yàn)分析，同時(shí)又不影響肝細(xì)胞和這種水凝膠。

為了滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，這些研究人員使用了一種商業(yè)化的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置（μ-Slide III 3D Perfusion IbiTreat），它包含兩個(gè)連續(xù)的腔室（2 x 30 μL）---每個(gè)腔室連接到培養(yǎng)基容器以便灌注液體。為了有效灌注，他們通過(guò)在含有這種水凝膠的腔室內(nèi)反轉(zhuǎn)灌注液流動(dòng)方向?qū)⑦@種三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置安裝在自動(dòng)搖床上。這種實(shí)驗(yàn)設(shè)置允許灌注的培養(yǎng)基通過(guò)這種三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置，這就滿足了第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。為了滿足第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，與這些水凝膠腔室相鄰的局部壁允許他們?cè)诓桓蓴_水凝膠或細(xì)胞成分的情況下對(duì)灌注液進(jìn)行取樣。

在細(xì)胞培養(yǎng)3天、7天和9天后，這些研究人員首先用這種水凝膠包埋的HEPG2細(xì)胞（一種肝癌細(xì)胞系）來(lái)研究肝臟芯片裝置的生物功能化。他們將這種水凝膠包埋的HEPG2細(xì)胞形態(tài)、活力和功能與瓊脂糖和藻酸鹽水凝膠進(jìn)行了比較。這項(xiàng)研究包括活/死細(xì)胞測(cè)定以確認(rèn)細(xì)胞活力，并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的白蛋白和尿素分泌來(lái)進(jìn)一步證實(shí)HepG2功能。

為了改善細(xì)胞的功能性（在材料表面上的附著力和遷移性），這些研究人員將細(xì)胞粘附基序---比如線性或環(huán)狀RGD肽（線性linRGD或環(huán)狀cRGD）---移植到這種水凝膠上。在這種情況下，將hipsC-HEP細(xì)胞（肝細(xì)胞干細(xì)胞）在不同的水凝膠組合物中培養(yǎng)13天，以研究細(xì)胞-材料相互作用后的形態(tài)和活力（活/死細(xì)胞染色）。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用了六種不同的基于水凝膠的生物材料表面，包括：二維生物材料表面（HEP涂層），瓊脂糖，藻酸鹽，HA-PEG，HA-PEG（linRGD）和HA-PEG（cRGD）。

在這種修飾的水凝膠中包埋和培養(yǎng)的hiPS-HEP細(xì)胞在二維構(gòu)建體和真正的三維構(gòu)建體內(nèi)生長(zhǎng)。為了測(cè)試這些體外培養(yǎng)的hiPS-HEP細(xì)胞的功能，這些研究人員定量確定了它們的白蛋白和尿素分泌。結(jié)果顯示僅在二維HEP涂層上和在cRGD基序水凝膠存在下培養(yǎng)的hips-HEP上清液分泌白蛋白。

基于這些研究結(jié)果，這些研究人員將二維HEP涂層上較高的白蛋白數(shù)量歸因于這種水凝膠中的白蛋白擴(kuò)散速率；在二維HEP涂層上的擴(kuò)散速度比三維構(gòu)建體中的快。在結(jié)合著cRGD基序的水凝膠中較高濃度的白蛋白與這種在結(jié)合著cRGD的生物材料表面上觀察到的細(xì)胞生長(zhǎng)和活力增加相關(guān)聯(lián)。因此，他們打算使用cRGD肽來(lái)協(xié)助hips-HEP在未來(lái)用于肝臟芯片裝置的水凝膠上的培養(yǎng)。

通過(guò)這種方式，這項(xiàng)研究詳細(xì)說(shuō)明了在肝臟芯片裝置中使用基于透明質(zhì)酸-PEG的經(jīng)過(guò)RGD肽修飾的水凝膠進(jìn)行肝細(xì)胞三維培養(yǎng)（將近13天）的優(yōu)點(diǎn)。作為這項(xiàng)研究的基準(zhǔn)，Christofferfsson及其同事們使用了常用的藻酸鹽和瓊脂糖水凝膠。在未來(lái)，他們將優(yōu)化這種HA-PEG水凝膠系統(tǒng)的粘彈性和細(xì)胞粘附基序的濃度，以便實(shí)現(xiàn)仿生細(xì)胞相容性。這種優(yōu)化的水凝膠系統(tǒng)可與這種肝臟芯片裝置相結(jié)合，從而有助于開發(fā)出生理上重要的肝臟芯片平臺(tái)，用于藥物毒理學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)和再生醫(yī)學(xué)方面的臨床研究。