數(shù)字微流控技術的基本原理芯片結構及在生物分析中的應用說明

近20年來，隨著微全分析系統(tǒng)（Micro-total-analysis syste, μTAS）和芯片實驗室（Lab-on-chip, LOC）概念的提出，微流控技術的興起對分析科學乃至整個自然科學體系的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。微流控技術作為一種基于微尺度效應的流體處理技術，其核心理念是通過構建微納器件將復雜的實驗室功能集成于單個分析設備或芯片上，實現(xiàn)分析系統(tǒng)的微型化與集成化。常規(guī)的微流控芯片以微通道為主體，通過閥、泵等外部構件實現(xiàn)對通道內微流體的操作和控制。然而，此類芯片結構復雜，加工難度大；需要外置泵、閥配合使用，難以集成化；易產(chǎn)生通道“死體積”，引起交叉污染。因此，近年來對微液滴操縱與控制新方法的研究成為國際微流控領域的研究重點。

數(shù)字微流控技術（Digital microfluidics, DMF）是一類新型液滴操縱技術的統(tǒng)稱，常見的驅動法有介電潤濕、介電泳、聲表面波、靜電力、磁力等。本文中DMF特指介電潤濕型的液滴操縱技術，其利用液滴在疏水化表面的介電潤濕現(xiàn)象，通過控制微電極陣列上液滴接觸角變化，實現(xiàn)離散液滴的精確控制。相比于傳統(tǒng)基于微通道的微流控芯片，DMF技術既保留了樣品消耗量少、熱轉換快速，以及具有高并行性和自動化的能力，同時不依賴微泵、微閥或微混合器等元件，甚至無需復雜的三維流體通道，具有構建簡單、可動態(tài)配置的優(yōu)點，因此特別適用于高集成度、高性能、操作復雜的生物、化學微全分析體系。

本文基于分析化學的視角對現(xiàn)階段DMF技術的發(fā)展進行了總結，同時分別在液滴驅動理論、芯片構建及具體應用等方面加以闡述。

數(shù)字微流控理論基礎

介電潤濕（Electrowetting-on-dielectric, EWOD）是指通過改變絕緣基板之間電壓，來改變基板上液滴的潤濕性（即改變接觸角），使液滴發(fā)生形變、位移的現(xiàn)象。其機理主要有兩種①Lippmann的能量觀點，即微液滴與介電層之間電荷積累產(chǎn)生的電容效應導致能量變化，引起微液滴表面張力改變從而使得接觸角變化。該理論用Lippman-Young方程描述EWOD現(xiàn)象，此方程由Berge在20世紀90年代通過合并Lippmann方程和Young方程得出：

cosθ = cosθ0+ ε0εrV2/( 2γ?)

式中，ε0表示真空介電常數(shù)；εr表示導電液滴的相對介電常數(shù)；γ表示氣/液表面的張力系數(shù)；?為介質層厚度；V為驅動電壓；θ0和θ分別表示施加驅動電壓前后的接觸角大小。由于該理論提出較早，相關的理論體系成熟，因此為多數(shù)人所接受。然而該理論無法解釋低表面張力液體無接觸角變化、不對稱EWOD效應、接觸角飽和效應等現(xiàn)象?；诖耍?000年Digilo等提出了基于電動力學的EWOD理論，主張微液滴三相接觸線上電荷累積產(chǎn)生的靜電力導致微液滴毛細管線張力改變，從而引起接觸角變化。該靜電力可用 Maxwell-Stress張量Tij表示（式2），其中，i和j分別為x、y和z軸的函數(shù)，δij為張量積δ，E為液滴周圍的電場。該公式解釋了不經(jīng)歷接觸角變化的液滴運動。

Tij=ε（EiEj－0.5δijE2）

基于介電潤濕的DMF技術最早由杜克大學的Fair等和加州大學洛杉磯分校的Kim等分別提出。以雙平板為例（圖1B），上板接通零電極，下板的電極接驅動電壓，液滴位于左右兩個驅動電極之間，當右側電極導通時，由式（1）可知，微液滴處于施加電壓的電極表面一側濕潤性發(fā)生改變，液滴左右兩側的接觸角不同，其內部產(chǎn)生的壓力差驅動微液滴沿著施加電壓的電極方向運動。按時序給驅動電極施加電壓，即可驅動微液滴沿著預設的路徑運動，實現(xiàn)對微液滴的操控。

數(shù)字微流控芯片的結構與構建

圖1B中描述了DMF設備的兩種常見模式：單平板模式（也稱為開放式）和雙平板模式（也稱為封閉式）。在單平板模式中，液滴直接負載于同時含有驅動電極和地電極的單個基板上；在雙平板模式中，液滴被夾在兩個有電極的基板之間。通常上板是一個由連續(xù)透明的導電銦錫氧化物（ITO）層形成的地電極，下板有一系列刻蝕好的驅動電極陣列。在這兩種模式中，下板均涂有絕緣介質層，且所有表面均被一層疏水性涂層覆蓋。兩種設備通常在空氣中運行，但越來越多的研究人員使用硅油等不與液滴混溶的材料作為填充介質，用以防止液滴揮發(fā)、減小液滴操縱所需的驅動電壓。雖然兩種模式的驅動原理類似，但單平板模式不能實現(xiàn)液滴的分裂及生成，而雙平板模式得益于三明治結構對液滴的剪切力，可以實現(xiàn)液滴的生成、分裂、混合和移動，因此具有更廣泛的應用。

圖1 數(shù)字微流控（DMF）芯片示意圖

A、DMF芯片上液滴操縱，包括混合、分裂、合并和生成；B、不同結構DMF示意圖

芯片結構的設計是DMF芯片實現(xiàn)液滴操縱功能的基礎。以雙平板模式為例，下板中驅動電極陣列主要分為儲液池電極、反應區(qū)電極及連接兩者的連接電極。儲液池電極面積較大，用于存儲反應試劑，并通過連接電極的逐級牽引實現(xiàn)液滴的生成。所生成液滴的體積由其被牽引到的最后一個電極的面積控制，體積的均一性受被操縱的電極形狀和電極數(shù)目影響；反應區(qū)電極是DMF芯片的主體部分，通過在反應區(qū)電極上的液滴操縱實現(xiàn)不同的功能，所需要的功能越復雜，反應區(qū)電極數(shù)目越多。針對不同目的，可在反應區(qū)電極上進行多層結構加工，包括納米探針、溫控模塊或三電極體系等，這是不同的DMF芯片結構上最大的區(qū)別。

在DMF芯片中，基板材料決定了芯片的加工過程和電極陣列的設計。玻璃優(yōu)良的化學惰性使之成為DMF芯片基板的首選。然而復雜的加工過程和高昂的價格使其難以大規(guī)模推廣。近年來，將造價低且易批量生產(chǎn)的印刷電路板（Printed circuit board, PCB）用作DMF芯片的基板受到眾多研究人員的推崇，這是因為多層PCB板的構建解決了玻璃和硅片芯片基板電極與外接點間布線困難的問題，使得大規(guī)模電極陣列的構建成為可能。此外，包括紙、柔性材料等基底的引入使得DMF芯片可應用于不同需求。表1總結了現(xiàn)階段DMF芯片常用的基底及其優(yōu)缺點。

DMF芯片的電極一般由金屬或其它導電材料構成。介電層用于促進電荷的積累和增加電場強度，以保證易于驅動液滴且不會造成擊穿。根據(jù)材料的不同，可選擇氣相沉積（派瑞林、氮化硅、非晶氟聚合物、熱生長（二氧化硅）、旋涂（聚二甲基硅氧烷、光刻膠）等不同方法形成介質層。疏水層一般是含氟聚合物（聚四氟乙烯），用于減少液滴驅動的表面能。

表1 DMF芯片的種類及優(yōu)缺點

數(shù)字微流控的應用

數(shù)字微流控技術作為一種通用性的新型離散微流體處理平臺，擁有許多獨特優(yōu)勢，因此在生物分析領域中得到了廣泛應用。

基于核酸的應用

分析DNA樣本或表征前，必須先進行純化和提取。Sista等利用注塑成型的聚碳酸酯作為上板， PCB作為下板，使用首款集成型盒式雙平板DMF芯片從遺傳損傷樣本中提取出人類基因組DNA。首先，將全血液滴與含有細胞裂解液的液滴混合，然后引入含DNA捕獲磁珠的液滴將細胞溶解產(chǎn)物中的DNA捕獲，通過磁鐵的輔助分離出磁珠，用緩沖液反復清洗實現(xiàn)分離和純化。該款集成DMF芯片具有可自動進樣、易操作、反應區(qū)大等優(yōu)點，因此引起了廣泛關注。DMF設備也被用于DNA轉染反應，Madison等將Ti∶Au電穿孔電極集成于DMF芯片的下板上，通過脈沖放電的形式對混合后分別含質粒DNA和大腸桿菌的液滴進行電穿孔，從而使質粒DNA轉染進大腸桿菌體內。這種基于DMF的電穿孔設備可實現(xiàn)多次自動化的連續(xù)轉染，操作簡單、反應快速，對于基因工程的亞微米尺度化發(fā)展起到了積極的作用。

聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction, PCR）是通過控制溫度和催化酶活性在不同溫度下完成三步循環(huán)反應的過程，是分子生物學中最強有力的工具之一。2010年，Hua等發(fā)展了一種全自動多通道DMF設備用于多路qPCR實驗，該設備使用集成型盒式DMF芯片（圖2A），并將反應所需的溫度控制、磁響應模塊和熒光檢測構件等集成于系統(tǒng)中（圖2A左）。將在體外使用磁珠提取的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌基因組DNA注入該裝置，可通過連續(xù)的磁珠富集、液滴移動和混合操作使基因組DNA與PCR混合物混合，并利用液滴在兩個熱源之間的不斷運動實現(xiàn)溫度循環(huán)（圖2A右），即能夠實現(xiàn)4路qPCR反應的同時進行。該系統(tǒng)利用DMF傳熱快、熱穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，通過簡單的液滴操縱實現(xiàn)了復雜的溫度循環(huán)，且能檢測到相當于低至單個細胞基因組的樣品量，同時擴增效率達94. 7%以上。

將DMF應用于DNA測序是一個新興的研究領域，而焦磷酸測序作為一種邊合成邊測序的方法，可通過連續(xù)的液滴混合分裂方式監(jiān)測其化學發(fā)光信號。Welch等利用簡單的T字型芯片結構驗證了DMF上的焦磷酸反應實驗：在3個儲液槽中分別放置反應所需的樣品、底物和酶，首先從儲液槽中分配出包含某一單一類型核苷酸底物和酶的液滴，并將其移至包含固定單段DNA樣品的位置。液滴孵化一段時間后將其移動到CCD相機下觀測化學發(fā)光信號，通過對磁珠的清洗即可進行下一次的反應。隨后，Boles等將該體系進一步集成化，并進行了DMF上的焦磷酸測序，在測序長度、測序精度和測序通量方面有了顯著提升。

圖2 DMF在生物大分子研究中的應用

A、一體化多路real-time PCR DMF芯片及設備；B、用于蛋白質提取的具有自動化磁分離體系的DMF芯片：（Ⅰ）磁鐵處于磁分離的位置時設備層的橫截面圖、（Ⅱ）DMF芯片上進行自動化蛋白質提取的流程；C、SERS-DMF免疫分析原理：（Ⅰ）SERS-DMF芯片俯視圖、（Ⅱ）拉曼信號分子4-MBA特征峰、（Ⅲ）SERS-DMF芯片截面圖、（Ⅳ）帶SERS探針的免疫復合物結構圖

蛋白質組學

蛋白質組學實驗過程中，在利用質譜或其他檢測器分析前通常需對大量樣本進行多次處理，DMF具有的陣列式并行操控能力使其在蛋白質組學研究領域獲得了廣泛應用。早期主要使用DMF平臺用于復雜基質中蛋白或多肽的純化，芯片結構基本為無表面修飾的雙平板模式，在其上進行多步的磁珠富集、清洗及液滴混合等基本操作即可完成實驗。Mei等使用偶聯(lián)有anti-HSA、Protein A和Protein G的磁珠捕獲緩沖液中的人血漿蛋白，通過簡單的液滴混合和磁珠分離即可完成DMF上的自動化蛋白質提?。▓D2B, Ⅰ）。該八通道芯片使用獨特的條狀磁棱鏡技術，可在10min內同時處理4個樣品，且IgG和HSA的提取效率達95%以上（圖2B, Ⅱ），使基質輔助激光解吸附質譜（MALDI-MS）的信噪比提升了近4倍，這種快速和自動化的提取方法大大提高了樣品處理的集成度和樣品檢測的靈敏度。

免疫分析與臨床診斷

免疫分析是利用抗原和抗體的特異性反應進行檢測，在臨床診斷和生化分析中具有廣泛應用。 然而常規(guī)免疫分析耗時長、成本高、操作復雜，且檢測設備較大。而DMF技術具有的分析速度快、試劑和樣品用量少、易集成化和自動化等特點在一定程度上能克服傳統(tǒng)免疫分析的缺點。Yang等設計了包裹有拉曼信號分子的核殼結構納米顆粒Au@MBA@Ag，該顆粒具有表面增強拉曼信號放大功能，可作為酶聯(lián)免疫吸附體系ELISA中的信號輸出（圖2C, Ⅳ）。當有靶標流感病毒H5N1存在時，修飾有捕獲抗體的磁珠和SERS顆粒的探針會與靶標形成三明治結構，用緩沖液清洗未結合的納米顆粒后，將芯片置于拉曼檢測器下即可實現(xiàn)檢出（圖2C, Ⅱ）。該款芯片可將反應試劑和反應操作自動化，并減小反應試劑體積，實現(xiàn)了流感病毒H5N1的快速、靈敏和線上一體化分析，并能夠用于血清復雜樣本的直接高靈敏檢測（圖2C, Ⅰ、Ⅲ）。

臨床診斷相比于正常的免疫分析更加注重實際樣本的檢測能力與準確度。Martin等首次證明了DMF芯片與生理體液的兼容性，建立了一種使用DMF在人類乳腺組織勻漿、全血和血清樣本中處理和提取雌激素的方法。該實驗將樣本溶解使雌激素被提取到極性溶劑中，其他成分被提取到非極性溶劑中。從樣本中提取的雌激素用LC-MS和ELISA進行監(jiān)測和量化，在提取量相同的條件下，該方法的樣本容量比傳統(tǒng)方法小1000倍，速度快20倍，因此有望用于乳腺癌的篩查與預診。Rackus等發(fā)展的紙基液體吸收預濃縮方法（P-CLIP）將高吸水能力的濾紙置于儲液槽中，在磁棱鏡控制捕獲有靶標分子磁珠的情況下，將微升甚至毫升級的樣品拖動至濾紙?zhí)帲ㄟ^其吸水能力使得樣品體積大幅減小，同時不損失樣品中的靶標分子。該方法能夠完成大體積生理樣品的直接上樣分析，使得DMF的適用環(huán)境更加廣闊。

基于細胞的應用

DMF由于具有可尋址性和高靈活性，相比傳統(tǒng)的微流控芯片更便于進行各種細胞的培養(yǎng)和分析，因此被廣泛應用于細胞相關領域的研究。Barbulovic-Nad等在2010年首次實現(xiàn)了芯片上哺乳動物細胞的培養(yǎng)，通過在上板疏水表面滴加纖連蛋白在芯片上得到局部親水的結構，當液滴通過該結構時會產(chǎn)生子液滴。使用該方法拖動含有細胞的液滴，殘留于子液滴中的細胞沉降后即可貼附于芯片表面上，并完成細胞消化（圖3A, Ⅰ、Ⅱ）和換液（圖3A, Ⅲ、Ⅳ），培養(yǎng)時間長達5 d以上。Wit-ters等使用濕法Lift-Off技術改進了DMF芯片上疏水化表面局部親水的方法，實現(xiàn)了結構可控的DMF芯片上局部親水化圖案的制備，完成了DMF芯片上黏附細胞的單細胞、多細胞及細胞團的表面固定（圖3B）。

近年來，隨著單細胞分析的快速發(fā)展，研究人員開始嘗試在DMF上進行單細胞分析。Wheeler 等首次開發(fā)了基于DMF的免疫細胞化學平臺，利用上板親水結構捕獲細胞，然后引入試劑流經(jīng)細胞對其靶蛋白和磷酸化蛋白標記，取下上板進行后續(xù)的染色和微陣列掃描即可實現(xiàn)血小板來源生長因子受體（PDGFR）磷酸態(tài)的應激響應過程研究（圖3C）。2015年，Rival等將細胞懸液大量稀釋后直接生成液滴得到1～3 個細胞，利用磁珠捕獲實現(xiàn)了mRNA的捕獲、純化和一步 qRT-PCR，該方法使用多層光刻技術構建了納升級的反應體系，有望用于單細胞轉錄組測序文庫的制備（圖3D）。

總結與展望

本文總結了DMF技術的基本原理、芯片結構及其在生物分析領域的應用。DMF在諸多領域中均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，特別是在核酸處理、臨床診斷和細胞分析等方面，可在一個設備上完成復 雜樣品的預處理和高通量分析。隨著以PCB為基底的DMF芯片進一步精良化、高通量化，以及可替換膜技術和快速打印技術的發(fā)展，DMF會變得更價廉、易得而且液滴驅動、檢測和分離等新技術的不斷改進，也會對DMF的發(fā)展與集成起到促進作用，使DMF設備變得更通用和集成， 更易于與其他儀器聯(lián)用。此外，由于DMF技術本身以模塊化和尋址性作為設計基礎，因此可在一個芯片上通過軟件配置實現(xiàn)多靶標的組合分析，有望在即時檢測領域得到進一步的應用。

然而，現(xiàn)階段DMF技術仍受制于加工成本高、技術要求高、穩(wěn)定性差等問題，使得其普及度低， 應用場景有限。DMF設備的復雜制造過程和商業(yè)儀器的缺乏，也進一步導致儀器使用度低，短時間內難以快速推廣。盡管DMF技術不夠成熟，但仍在不斷改進，隨著大規(guī)模生產(chǎn)技術的發(fā)展和通用DMF儀器的發(fā)展，其在分析化學和其他領域將有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖3 基于細胞的應用

A、DMF上含CHO-K1細胞子液滴的形成及培養(yǎng)；B、Teflon-AF表面FITC標記的PLL熒光圖案；C、用于單細胞分析的DMF免疫細胞化學平臺；D、DMF上單細胞用于基因表達分析的mRNA提取、純化和RT-PCR流程